白 云， 郭芮名倩， 王 妍， 胡 瑩，張興華， 苗建新， 李崇文， 董 仕

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3.天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司，天津 301500）

拉氏鱥（Phoxinus lagowskii），又稱(chēng)洛氏鱥，俗稱(chēng)“柳根魚(yú)”、“柳根子”[1]，屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）雅羅魚(yú)亞科（Leuciscinae）鱥屬（Phoxinus），主要分布在黑龍江、圖們江、鴨綠江、黃河中上游等水域，是所有鱥屬中生長(zhǎng)最快、個(gè)體最大的一種.拉氏鱥體質(zhì)量一般為20～40 g， 人工養(yǎng)殖個(gè)體最大可達(dá)到500 g[2].拉氏鱥體型較長(zhǎng)，呈紡錘型，體背部灰黃色并帶有小的黑色斑點(diǎn)，具有味道鮮美、肉質(zhì)好、蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸含量高等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此價(jià)格較高.近年來(lái)，隨著環(huán)境變化和過(guò)度捕撈，拉氏鱥的數(shù)量逐漸減少，急需人工養(yǎng)殖來(lái)滿(mǎn)足市場(chǎng)需要[3].由于拉氏鱥特殊的繁殖習(xí)性， 人工催產(chǎn)自然產(chǎn)卵的難題始終未能解決，因此難以實(shí)現(xiàn)苗種的批量生產(chǎn)，養(yǎng)殖苗種無(wú)法得到保障.現(xiàn)階段我國(guó)拉氏鱥的人工養(yǎng)殖開(kāi)始起步，在東北三省的人工養(yǎng)殖有零星報(bào)道[2].

DNA 條形碼技術(shù)是 Hebert 等[4-5]于 2003 年提出的“測(cè)定線粒體DNA COI 區(qū)段堿基序列， 進(jìn)而進(jìn)行物種鑒定”的一種方法.線粒體DNA 又稱(chēng)mtDNA，為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞核外具備自主DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及翻譯能力的雙鏈DNA 分子[6].COI 區(qū)段全稱(chēng)為線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶I 亞基（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COI），具有進(jìn)化速率快、包含遺傳進(jìn)化的信息量大以及各類(lèi)群間序列差異較明顯等優(yōu)點(diǎn)，因此在DNA條形碼技術(shù)中，此區(qū)段具有較高的物種鑒定的可靠性[7-8].利用DNA COI 區(qū)段進(jìn)行魚(yú)類(lèi)遺傳多樣性的研究已有一些報(bào)道.如張大莉等[9]對(duì)大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種的COI 區(qū)段序列分析表明， 后者mtDNA COI 區(qū)段的遺傳多樣性高于前者，該序列可作為鑒別2 個(gè)亞種的DNA 條形碼.沙航等[10]報(bào)道了長(zhǎng)江中上游6 個(gè)群體鰱COI 的遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)的個(gè)體間，群體間具有明顯的遺傳分化.謝佳燕等[11]對(duì)蒙古鲌5 個(gè)群體的COI 基因序列的分析結(jié)果表明，不同種群間的遺傳多樣性存在一定差異但尚未形成明顯的譜系地理結(jié)構(gòu).

本研究利用DNA 條形碼技術(shù)，檢測(cè)分析了40 尾拉氏鱥mtDNA COI 區(qū)段的堿基排列順序及遺傳多樣性，并進(jìn)行了不同大小拉氏鱥遺傳差異的比較，其結(jié)果可為拉氏鱥的物種鑒定和育種提供資料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2018 年2 月28 日，從天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司采集2017 年春季同批次人工繁殖、 同池養(yǎng)殖的拉氏鱥865 尾， 測(cè)量體長(zhǎng)和體質(zhì)量.拉氏鱥的個(gè)體大小差異明顯，體質(zhì)量范圍為1.33～96.99 g.按照體質(zhì)量從中選取大、中、小不同個(gè)體40 尾，進(jìn)行組間遺傳差異的比較和拉氏鱥mtDNA COI 區(qū)段遺傳多樣性分析.3 種體型拉氏鱥的體長(zhǎng)和體質(zhì)量如表1 所示.

表1 拉氏鱥個(gè)體的數(shù)量、體長(zhǎng)和體質(zhì)量Tab.1 Length and body mass of Phoxinus lagowskii

1.2 總DNA的提取

剪取大小約1.0 cm×1.0 cm 的鰭條，采用苯酚-氯仿抽提法提取總DNA，保存在4 ℃下備用[12].

1.3 mtDNA COI區(qū)段的PCR擴(kuò)增

依據(jù)GenBank 上的KC967217 設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增拉氏鱥mtDNA COI 區(qū)段的一對(duì)引物，LSGCO1 序列為5′-TAT TCT GCG TTT CTG GAT TT-3′，LSGCO2 序列為5′-TCT TCT ATT ACG GGT GAT GC-3′，結(jié)合位點(diǎn)分別位于tRNACys和COⅡ2 個(gè)編碼區(qū)上，PCR 反應(yīng)體系參照王淞等[13]的方法.獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Bioedit 軟件將序列轉(zhuǎn)為Fasta 格式， 經(jīng)Seqverter 軟件進(jìn)行整合，用Clustalx1.83 軟件將序列的突變位點(diǎn)與峰圖比對(duì)后獲得排列清晰的序列， 再用MEGA7.0 軟件得出堿基差異和堿基頻率，基于Kimura2-parameter 計(jì)算組內(nèi)和組間遺傳距，并構(gòu)建NJ 系統(tǒng)樹(shù).使用Dnasp 軟件計(jì)算單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）以及平均核苷酸差異性（k）.

2 結(jié)果與分析

2.1 865尾拉氏鱥的體質(zhì)量分布

本研究采集的865 尾拉氏鱥的體質(zhì)量分布如圖1所示.由圖1 可以看出， 中等偏大體型的個(gè)體數(shù)量最多，其次是小體型，體質(zhì)量較大的個(gè)體數(shù)量最少.

2.2 mtDNA COI區(qū)段的PCR產(chǎn)物

對(duì)選取的40 尾不同體型的拉氏鱥進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均獲得了約1.85 kb 大小的DNA 片段，部分個(gè)體的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2 所示.對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，與測(cè)序公司提供的測(cè)序峰圖進(jìn)行比對(duì)，獲得堿基排列順序清晰的DNA 片段長(zhǎng)度為1 551～1 552 bp，經(jīng)與 GenBank 中的 KC967217（物種名：Rhynchocypris cf lagowskii）比對(duì)，序列全部在 COI 區(qū)段.

圖1 拉氏鱥體質(zhì)量的分布Fig.1 Distribution of body mass of Phoxinus lagowskii

圖2 拉氏鱥mtDNA COI 區(qū)段的PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophorescs results of the PCR product of mtDNA COI region in Phoxinus lagowskii

2.3 拉氏鱥的堿基差異

40 尾拉氏鱥共有128 個(gè)位點(diǎn)存在堿基差異，有23 種單倍型（haplotype）.計(jì)算單倍型間 Kimura 2-parameter 遺傳距，通過(guò)與 KC967217、KF734881（物種名：Rhynchocypris lagowskii）、AP009147（物種名：Rhynchocypris lagowskii）比較，23 種單倍型可以分為 2 種類(lèi)型：類(lèi)型1 為單倍型Ⅰ～ XX；類(lèi)型2 為單倍型XXI～XXⅢ.類(lèi)型1 中的37 尾拉氏鱥有34 個(gè)位點(diǎn)存在堿基差異，如表2 所示；類(lèi)型2 中的3 尾拉氏鱥有8 個(gè)位點(diǎn)存在堿基差異， 如表3 所示.類(lèi)型1 各單倍型中堿基T 和A 的含量小于類(lèi)型2 中的含量， 堿基C 和G的含量大于類(lèi)型2 中的含量，如表4 所示.2 種類(lèi)型各單倍型中不同大小拉氏鱥的個(gè)體數(shù)如表5 所示.

2.4 拉氏鱥的遺傳距和系統(tǒng)樹(shù)

2.4.1 單倍型間的Kimura2-parameter 遺傳距

類(lèi)型1 拉氏鱥（單倍型Ⅰ～XX）中，20 種單倍型間以及與KC967217、KF734881 間的Kimura 2-parameter遺傳距范圍在0.000 00～0.010 42 之間.類(lèi)型2 拉氏鱥（單倍型XXI～XXIII）中，3 種單倍型間以及與AP009147間的遺傳距范圍在0.001 29～0.003 23 之間.類(lèi)型1 與類(lèi)型2 間的遺傳距范圍在0.073 75～0.080 48 之間.由此認(rèn)為，類(lèi)型1 與KC967217 和KF734881 相近，類(lèi)型2 與 AP009147 相近， 如表 6 所示.2 種類(lèi)型拉氏鱥間存在明顯的遺傳差異.

表2 拉氏鱥類(lèi)型1 中單倍型的堿基差異Tab.2 Nucleotide diversity of the haplotypes in type 1 of Phoxinus lagowskii

表3 拉氏鱥類(lèi)型2 中單倍型的堿基差異Tab.3 Nucleotide diversity of the haplotypes in type 2 of Phoxinus lagowskii

表4 拉氏鱥單倍型的堿基組成Tab.4 Nucleotide composition of the haplotypes of Phoxinus lagowskii

表5 各單倍型中拉氏鱥個(gè)體數(shù)Tab.5 Individual number of different haplotypes in Phoxinus lagowskii

表6 拉氏鱥單倍型間Kimura 2-parameter 遺傳距范圍Tab.6 Range of Kimura 2-parameter genetic distance among different haplotypes in COI region of Phoxinus lagowskii

2.4.2 類(lèi)型1 和類(lèi)型2 的組內(nèi)與組間遺傳距

2 種類(lèi)型拉氏鱥中組內(nèi)和組間的遺傳距如表7 所示.類(lèi)型1 中37 尾拉氏鱥組內(nèi)Kimura 2-parameter 遺傳距平均值為0.001 71，與KC967217 和KF734881 間的平均值分別為0.000 93 和0.007 86，與類(lèi)型2 組間的平均值為0.07596，與AP009147 的平均值為0.073 97.類(lèi)型2 中3 尾拉氏鱥組內(nèi)遺傳距平均值為0.002 59，與 AP009147 的平均值為 0.002 80， 與 KC967217 和KF734881 間的平均值分別為0.075 74 和0.076 44.

表7 拉氏鱥COI 區(qū)段的Kimura 2-parameter 遺傳距Tab.7 Kimura 2-parameter genetic distance in COI region of Phoxinus lagowskii

2.4.3 大、中、小拉氏鱥的組內(nèi)和組間遺傳距

類(lèi)型1 中的大、中、小個(gè)體拉氏鱥組內(nèi)、組間的Kimura 2-parameter 遺傳距如表8 所示.遺傳距范圍為0.001 23～0.001 97，大、中、小3 組拉氏鱥之間的差異不明顯.

表8 不同體質(zhì)量拉氏鱥COI 區(qū)段的Kimura 2-parameter遺傳距離Tab.8 Kimura 2-parameter genetic distance in COI region of different body mass of Phoxinus lagowskii

2.4.4 拉氏鱥的系統(tǒng)樹(shù)

40 尾拉氏鱥的系統(tǒng)樹(shù)如圖3 所示.類(lèi)型1 中的37 尾拉氏鱥與 KC967217 和 KF734881 為一支； 類(lèi)型2 中的3 尾與AP009147 為一支.拉氏鱥的聚類(lèi)與大、中、小個(gè)體間未見(jiàn)顯著關(guān)聯(lián).

圖3 不同體質(zhì)量拉氏鱥mtDNA COI 區(qū)段的NJ 系統(tǒng)樹(shù)Fig.3 NJ phylogenetic tree in COI region of different body mass of Phoxinus lagowskii

2.5 拉氏鱥的遺傳多樣性指數(shù)

類(lèi)型1 拉氏鱥的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）及平均核苷酸差異性（k）分別為0.862、0.001 71 和 2.646， 類(lèi)型 2 拉氏鱥的 Hd、Pi和 k 分別為1.000、0.002 58 和4.000.類(lèi)型2 拉氏鱥的遺傳多樣性略高于類(lèi)型1 的多樣性.

3 討論與結(jié)論

對(duì)于拉氏鱥所在屬及種的中文名、拉丁名，迄今仍沒(méi)有統(tǒng)一定論.成慶泰等[14]使用的屬名、種名為鱥屬、洛氏鱥Phoxinus lagowskii；川那部浩哉等[15]命名為Phoxinus lagowski；許旺[16]使用的屬名、種名為大吻鱥屬、拉氏大吻鱥Rhynchocypris lagowskii，且存在拉氏大吻鱥的相似種Rhynchocypris cf lagowskii.mtDNA COI 區(qū)段作為一種DNA 遺傳標(biāo)記常用于遺傳多樣性檢測(cè)、系統(tǒng)分類(lèi)以及物種鑒定等研究[4-8].Hebert 等[4-5]對(duì)11 個(gè)門(mén)類(lèi)2 238 種動(dòng)物間的遺傳差異進(jìn)行比較，認(rèn)為種內(nèi)遺傳距大多數(shù)在1%以下，很少超過(guò)2%，3%的遺傳距可作為種類(lèi)鑒別的標(biāo)準(zhǔn).本研究選取了同批次相同條件下培養(yǎng)的40 尾體質(zhì)量大小不一的拉氏鱥，對(duì)它們的線粒體DNA COI 區(qū)段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 得到了23 種單倍型.計(jì)算 Kimura 2-parameter 遺傳距，40 尾拉氏鱥可以明顯地分為類(lèi)型1（37 尾）和類(lèi)型2（3 尾）.2個(gè)類(lèi)型組內(nèi)單倍型間的遺傳距均小于1%，而2 種類(lèi)型間以及2 種類(lèi)型的各單倍型間的遺傳距均在7%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于3%.如以3%的Kimura 2-parameter 遺傳距為基準(zhǔn)，可認(rèn)為本研究中的類(lèi)型1 與類(lèi)型2 的母本應(yīng)來(lái)自于2 個(gè)不同物種.類(lèi)型1 與KF734881（物種名：Rhynchocypris lagowskii）和 KC967217（物種名：Rhynchocypris cf lagowskii）相近，類(lèi)型 2 與AP009147（物種名：Rhynchocypris lagowskii）相近.本文認(rèn)為KF734881 與AP009147 應(yīng)為不同物種，由于實(shí)驗(yàn)中的拉氏鱥為人工繁殖后代，因此2 種類(lèi)型母本的具體種名有待進(jìn)一步研究.

在拉氏鱥養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，同時(shí)間人工繁殖、同池養(yǎng)殖的拉氏鱥個(gè)體間的體長(zhǎng)、體質(zhì)量差異明顯.根據(jù)體質(zhì)量將拉氏鱥分為大、中、小3 組，進(jìn)行組內(nèi)和組間遺傳差異檢測(cè)分析.大個(gè)體拉氏鱥的平均體長(zhǎng)是小個(gè)體拉氏鱥的2.36 倍，體質(zhì)量為17.47 倍.類(lèi)型1 中3 組拉氏鱥的組內(nèi)、組間遺傳距范圍為0.001 23～0.001 97，遺傳差異不明顯.本研究中測(cè)量的865 尾拉氏鱥的體長(zhǎng)和體質(zhì)量呈正態(tài)分布，養(yǎng)殖過(guò)程出現(xiàn)差異明顯的個(gè)體可能歸因于個(gè)體間的攝食能力差異.類(lèi)型1 拉氏鱥的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）及平均核苷酸差異性（k）分別為 0.862、0.001 71 和 2.646，類(lèi)型 2 拉氏鱥的 Hd、Pi和 k 分別為 1.000、0.002 58 和4.000.類(lèi)型2 拉氏鱥的遺傳多樣性高于類(lèi)型1.張大莉等[9]報(bào)道了大口黑鱸北方亞種COI 區(qū)段的Hd、Pi和k 均為 0，佛羅里達(dá)亞種的 Hd、Pi、k 分別為 0.784、0.0034 2 和4.573.沙航等[10]報(bào)道了長(zhǎng)江中上游6 個(gè)群體鰱 COI 的 Hd為 0.047 6～0.094 5、Pi為 0.001 96～0.009 82.本研究中2 種類(lèi)型拉氏鱥的Hd均高于大口黑鱸的2個(gè)亞種，Pi和k 指數(shù)高于北方亞種， 低于佛羅里達(dá)亞種； 拉氏鱥的Hd遠(yuǎn)高于6 個(gè)群體鰱，Pi指數(shù)則低于6個(gè)鰱群體.