馬 陽(yáng)，王文軍，黃少杰，雷 露，王 凱，封小娜，丁 一*，文愛(ài)東*

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712046；2空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710032

冠心病(coronary heart disease，CHD)又稱(chēng)冠狀動(dòng)脈性心臟病，是一種由冠狀動(dòng)脈血流量減少導(dǎo)致的心肌缺血、缺氧甚至壞死進(jìn)而導(dǎo)致的心臟疾病，亦稱(chēng)缺血性心臟病[1]。CHD是心血管疾病的主要形式之一，心腦血管疾病發(fā)病率和死亡率高，對(duì)人類(lèi)健康和生命造成了嚴(yán)重的威脅[2]。目前，治療CHD臨床上常用的方法是外科治療、西藥治療和中藥治療，較西藥而言中藥復(fù)方在治療CHD上具有一定的優(yōu)點(diǎn)，它可以從多靶點(diǎn)、多通路等角度對(duì)疾病進(jìn)行全面的治療，在臨床上也取得了較為顯著的療效[3]。

在眾多的現(xiàn)代研究中，丹參-葛根聯(lián)合應(yīng)用于多種中藥復(fù)方中，即丹參葛根湯，具有抗氧化、舒張血管作用，可改善冠心病患者的脂質(zhì)分布、血管功能和結(jié)構(gòu)[4]。研究表明丹參葛根聯(lián)用治療冠心病心絞痛的療效比硝酸甘油更優(yōu)，不良反應(yīng)更少[5]。丹參-葛根合用針對(duì)病位在血脈或經(jīng)脈的瘀血阻滯，葛根促進(jìn)血管平滑肌的運(yùn)動(dòng)，來(lái)促進(jìn)血液循環(huán)；丹參可以清除出血后或者血流緩慢引起的血管內(nèi)外血液瘀滯，確保血流暢通。然而，其治療機(jī)制仍不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)采用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算等方法，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，系統(tǒng)地觀察藥物與疾病的關(guān)系，解釋了多組分藥物協(xié)同作用的特點(diǎn)[6]。利用專(zhuān)業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件系統(tǒng)、整體地揭示藥物與機(jī)體的相互作用規(guī)律及機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重整體性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)，符合中醫(yī)藥理論[7]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究丹參-葛根藥對(duì)治療CHD的作用機(jī)制，為該藥對(duì)的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用軟件及在線工具

本次研究需要使用大量的軟件及在線工具，首先在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)及Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物靶標(biāo)預(yù)測(cè)，在DrugBank、Therapeutic Target Database (TTD)和Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行冠心病發(fā)病機(jī)制靶標(biāo)的預(yù)測(cè)，然后ChemDraw軟件中繪制化合物結(jié)構(gòu)式，在STRING線數(shù)據(jù)庫(kù)中繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID)進(jìn)行京都基因與基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本體(Gene ontology，GO)富集分析，安裝Cytoscape軟件進(jìn)行分析并繪圖，詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)表1。

表1 本次研究使用的軟件及在線工具

1.2 冠心病靶點(diǎn)獲取

以Coronary Heart Disease為關(guān)鍵詞在TTD、DrugBank和Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)CHD的相關(guān)靶點(diǎn)。將檢索到的蛋白名稱(chēng)復(fù)制到Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行校正，整理并篩除重復(fù)項(xiàng)。

1.3 丹參和葛根成分和靶點(diǎn)獲取

研究以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類(lèi)藥性(drug likeness，DL)為主的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。OB通常用于確定口服給藥的藥物，其可能消除許多障礙以進(jìn)入全身血液循環(huán)。DL用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)“化合物”的含義，這可以很容易地幫助優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)和藥物特性，如溶解度和化學(xué)穩(wěn)定性[8]。以“丹參”和“葛根”為關(guān)鍵詞，通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取丹參-葛根的活性成分，篩選標(biāo)準(zhǔn)為OB≥30%且DL≥0.18[9]，將篩選所得的活性成分找到作用的蛋白名稱(chēng)，將蛋白名稱(chēng)復(fù)制到Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中以提取相應(yīng)的靶點(diǎn)，整理并篩除重復(fù)項(xiàng)。

1.4 共有靶點(diǎn)篩選

將上述所獲取的活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1網(wǎng)站中得到化合物-疾病共有靶點(diǎn)個(gè)數(shù)，并繪制韋恩圖。

1.5 共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，“minimum required interaction score(≥0.9)”并且隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)的節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取相互作用關(guān)系，將相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件繪制靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，然后再使用該軟件中的Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并根據(jù)連接度(Degree，PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)連接的邊的個(gè)數(shù)；Degree值越大，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)聯(lián)系更緊密，在網(wǎng)絡(luò)中越重要)調(diào)整節(jié)點(diǎn)的大小并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析

將1.4收集得到的共有靶點(diǎn)的官方縮寫(xiě)上傳到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，限定靶基因名稱(chēng)列表為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO富集分析包括分子功能(molecular function，MF)，細(xì)胞組分(cellular component，CC)和生物過(guò)程(biological proess，BP)三個(gè)部分。查閱相關(guān)資料分析對(duì)所得到的涉及靶點(diǎn)較多的通路進(jìn)行分析，并繪圖。

1.7 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將1.6得到的分?jǐn)?shù)較高的通路和1.4收集到的共有靶點(diǎn)以及藥物活性成分利用Cytoscape 3.6.0軟件繪制成“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 冠心病靶點(diǎn)獲取

通過(guò)檢索DrugBank、TTD和Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的靶點(diǎn)并導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)校正后分別篩選到84、6和913個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)項(xiàng)后共納入981個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 丹參合葛根化學(xué)成分及靶點(diǎn)獲取

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)設(shè)定的OB≥30%，DL≥0.18參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，共得到61個(gè)成分和納入176個(gè)靶點(diǎn)。丹參和葛根的化合物信息如表2所示。

表2 丹參和葛根主要活性成分表

續(xù)表2(Continued Tab.2)

標(biāo)識(shí)TCMSP ID結(jié)構(gòu)式Structure化合物名稱(chēng)Compound口服生物利用度OB(%)類(lèi)藥性DL(%)MOL002651Dehydrotanshinone II A43.760.4MOL002776Baicalin40.120.75MOL000569Digallate61.850.26MOL000006Luteolin36.160.25MOL0070365,6-Dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-2,3-dihydro-phenanthren-4-one33.770.29MOL0070412-Isopropyl-8-methyl-phenanthrene-3,4-dione40.860.23MOL0070453α-HydroxytanshinoneⅡA44.930.44MOL007048(E)-3-[2-(3,4-di-hydroxyphenyl)-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid48.240.31MOL0070494-Methylenemiltirone34.350.23MOL0070502-(4-Hydroxy-3-methoxy-phenyl)-5-(3-hydroxypro-pyl)-7-methoxy-3-benzo-furancarboxaldehyde62.780.4

續(xù)表2(Continued Tab.2)

標(biāo)識(shí)TCMSP ID結(jié)構(gòu)式Structure化合物名稱(chēng)Compound口服生物利用度OB(%)類(lèi)藥性DL(%)MOL007058Formyltanshinone73.440.42MOL0070593-Beta-Hydroxymethylle-netanshiquinone32.160.41MOL007061Methylenetanshinquinone37.070.36MOL007063Przewalskina37.110.65MOL007064Przewalskinb110.320.44MOL007068Przewaquinone B62.240.41MOL007069Przewaquinone C55.740.4MOL007070(6S,7R)-6,7-dihydroxy-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-dione41.310.45MOL007071Przewaquinone F40.310.46MOL007077Sclareol43.670.21MOL007079Tanshinaldehyde52.470.45

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

標(biāo)識(shí)TCMSP ID結(jié)構(gòu)式Structure化合物名稱(chēng)Compound口服生物利用度OB(%)類(lèi)藥性DL(%)MOL007132(2R)-3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid109.380.35MOL007141Salvianolic acid G45.560.61MOL007142Salvianolic acid J43.380.72MOL007143Salvilenone Ⅰ32.430.23MOL007145Salviolone31.720.24MOL007150(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-quinone75.390.46MOL007151Tanshindiol B42.670.45MOL007152Przewaquinone E42.850.45MOL007154Tanshinone ⅡA49.890.4MOL007155(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-dione65.260.45

續(xù)表2(Continued Tab.2)

標(biāo)識(shí)TCMSP ID結(jié)構(gòu)式Structure化合物名稱(chēng)Compound口服生物利用度OB(%)類(lèi)藥性DL(%)MOL007156Tanshinone Ⅵ45.640.3葛根MOL000392Formononetin69.670.21MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL0029593′-Methoxydaidzein48.570.24MOL012297Puerarin[10]24.030.39

2.3 共有靶點(diǎn)篩選

將丹參和葛根的靶點(diǎn)和CHD的靶點(diǎn)通過(guò)Venny2.1構(gòu)建韋恩圖篩選共有靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。這些靶點(diǎn)既是藥物作用的靶點(diǎn)，也是疾病的靶點(diǎn)。故丹參-葛根很可能是通過(guò)這些靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。

圖1 CHD和活性成分靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 CHD and active ingredient target Venn diagram

表3 藥物與疾病共有靶點(diǎn)表格

2.4 共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將68個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，以獲取相互作用關(guān)系，再使用 Cytoscape 3.6.1繪制靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖 2。此網(wǎng)絡(luò)共包括68個(gè)節(jié)點(diǎn)，160條邊，平均Degree值為4.71，PPI富集P值<1.0e-16。圖中Degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大，結(jié)果提示丹參-葛根合用治療CHD的靶標(biāo)中Degree值排名前10的靶蛋白為AKT1、TNF、APP、ENDI、VEGFA、TP53、IL6、AGTR1、F2、RXRA。

圖2 活性成分與疾病共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network map of active components and diseases

2.5 GO富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO富集分析(P<0.05)，將分析數(shù)據(jù)下載下來(lái)，把Count 值前五名做柱狀圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖3所示。從生物過(guò)程的富集結(jié)果來(lái)講，丹參-葛根治療CHD的靶標(biāo)主要參與RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄、DNA模板轉(zhuǎn)錄和炎癥反應(yīng)等過(guò)程的調(diào)節(jié)；從細(xì)胞組分的富集結(jié)果來(lái)說(shuō)，丹參-葛根治療CHD的靶標(biāo)主要集中于細(xì)胞外空間、質(zhì)膜和核等部位；從分子功能富集結(jié)果來(lái)說(shuō)，丹參-葛根治療CHD的作用主要體現(xiàn)在鋅離子結(jié)合、細(xì)胞因子活性和序列特異性DNA結(jié)合等方面。

表4 GO富集分析結(jié)果

續(xù)表4(Continued Tab.4)

類(lèi)型TypeGO富集GO Enrichment-log10值-log10 valueTranscription factor activity,sequence-specific DNA binding2.644 805 558Cytokine activity5.302 815 183Heme binding4.490 704 727CCExtracellular space9.419 996 155Plasma membrane2.823 022 69Nucleus1.599 008 676Integral component of plasma membrane1.682 525 526Cytosol1.591 033 308BPPositive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter7.893 632 792Transcription,DNA-templated3.680 761 64Inflammatory response4.086 251 625Positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade4.583 008 521Positive regulation of transcription,DNA-templated3.099 745 564

圖3 GO富集分析結(jié)果柱狀圖Fig.3 GO enrichment analysis results histogram注：MF：分子功能；CC：細(xì)胞組成；BP：生物過(guò)程。Note:MF:Molecular function;CC:Cell composition;BP:Biological process.

2.6 KEGG通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中KEGG分析結(jié)果如表5所示，把Count 值前20個(gè)通路做柱狀圖分析，結(jié)果如圖4所示。將KEGG分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中通過(guò)“CluGo插件”進(jìn)行KEGG通路富集(P<0.05)，結(jié)果如圖5。從圖中可以看出包括炎癥過(guò)程和免疫抑制(如TNF信號(hào)通路，T細(xì)胞受體信號(hào)通路)，心血管系統(tǒng)(如PI3K-Akt信號(hào)通路)和神經(jīng)活性配體受體相互作用。丹參-葛根治療CHD的主要作用過(guò)程包括HIF-1、PI3K-Akt、TNF和T細(xì)胞受體等信號(hào)通路。

2.7 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.6.0軟件繪圖結(jié)果如圖6所示。由結(jié)果可知丹參-葛根配伍活性協(xié)同作用于成分多個(gè)靶點(diǎn)和多條通路，提示兩藥配伍可能有協(xié)同增效作用。如丹參中的丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、木犀草素(luteolin)與葛根中的葛根素(puerarin)涉及共有靶點(diǎn)的數(shù)目最多表示丹參-葛根配伍后主要是這三個(gè)活性成分來(lái)發(fā)揮藥效的；這些活性成分又同時(shí)通過(guò)TNF、VEGFA、TP53和IL6等靶點(diǎn)，協(xié)同作用于HIF-1、PI3K-Akt、Jak-STAT和TNF等信號(hào)通路，表明丹參-葛根配伍使用較單味藥的藥效強(qiáng)。

表5 KEGG通路富集分析

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究丹參-葛根治療CHD的作用機(jī)制。結(jié)果顯示有68個(gè)與CHD相關(guān)的靶標(biāo)，PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，丹參-葛根配伍后可能存在協(xié)同作用參與 AKT1、TNF、VEGFA、TP53、IL6等靶點(diǎn)，提示該藥對(duì)在治療CHD中具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。TNF是一種細(xì)胞因子，通常與炎癥反應(yīng)有關(guān)，其中TNF-α是一種非常重要的促炎因子，同時(shí)又能通過(guò)刺激相關(guān)血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)引起缺血后血管再生[11]；此外，VEGFA是促血管生成神經(jīng)保護(hù)因子，可誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生[12]；IL6作為最重要的中樞基因，是一種T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，參與多種生物活動(dòng)，如嚴(yán)重的相位反應(yīng)的產(chǎn)生、身體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)以及與運(yùn)動(dòng)期間的新陳代謝有關(guān)[13]；TP53是一種廣泛表達(dá)于胚胎和腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄因子[14]。近年來(lái)的研究表明，TP53在平滑肌細(xì)胞分化中也發(fā)揮調(diào)控作用，提示對(duì)新靶點(diǎn)分子的識(shí)別，可能為心血管疾病的治療帶來(lái)新的藥物啟示[15]。KEGG代謝通路富集分析結(jié)果表明，丹參-葛根治療CHD涉及HIF-1、PI3K-Akt、Jak-STAT和TNF等信號(hào)通路。TNF信號(hào)通路可促使促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和TNF-α本身等基因的表達(dá)放大炎癥反應(yīng)和免疫效應(yīng)[16]；HIF-1信號(hào)通路是缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路，HIF-1的活性對(duì)于組織缺血后的恢復(fù)是十分必要的。HIF-1可以上調(diào)與血管系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，如促進(jìn)血管生成的VEGF及其受體;使血管收縮的物質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等來(lái)增加血流，降低缺血損傷[17]；臨床研究表明，PI3K-Akt 通路在CHD的發(fā)生和發(fā)展中起著特殊的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮再生、 物質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)，可影響CHD的發(fā)展[18]；Jak-STAT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，而Cagnin等[19]通過(guò)DNA微陣列和meta分析人類(lèi)冠脈粥樣硬化斑塊修飾基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Jak-STAT通路在心血管保護(hù)中起著重要的作用。有研究表明丹參酮ⅡA和葛根素協(xié)同作用于PI3K-Akt通路，對(duì)心腦血管疾病產(chǎn)生保護(hù)作用[20,21]。有研究表明，丹參-葛根合用較單獨(dú)使用抗炎作用、舒張血管作用都明顯增加，合用的療效對(duì)心腦血管疾病都有很好的保護(hù)作用[22,23]。藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示丹參中的丹參酮ⅡA、木犀草素和葛根中的葛根素涉及共有靶點(diǎn)數(shù)目最多，提示這些化學(xué)成分可能參與了丹參-葛根配伍治療CHD的過(guò)程。

圖4 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis results

圖5 丹參-葛根治療CHD信號(hào)通路富集分析圖Fig.5 Analysis of enrichment of CHD signaling pathway in Danshen-Gegen

圖6 藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Drug component-target-pathway network diagram注：橙色橢圓：活性成分；藍(lán)色六邊形：靶點(diǎn)；粉色長(zhǎng)方形：通路。Note:Orange ellipse:active ingredient;blue hexagon:target;pink rectangle:pathway.

本研究結(jié)果表明，丹參-葛根中丹參酮ⅡA、木犀草素和葛根素等成分對(duì)TNF、VEGFA、TP53和IL6等相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)HIF-10、PI3K-Akt、TNF和Jak-STAT等信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)、血壓調(diào)節(jié)、血管生成和收縮調(diào)節(jié)等過(guò)程。綜上，丹參-葛根治療冠心病的過(guò)程涉及多中有效成分、靶點(diǎn)和通路，符合中醫(yī)藥治療疾病多成分多靶點(diǎn)多通路的特點(diǎn)；同時(shí)，本研究也可作為丹參-葛根治療冠心病的分子機(jī)制，為深入研究丹參-葛根治療CHD的作用機(jī)制提供思路和參考。