金 鑫，熊 川，李 萍，李 強(qiáng)，陳祖琴，張 璐，黃文麗*

1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，成都 610061；2成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106

靈芝(GanodermalingzhiSheng H.Wu,Y.Cao & Y.C.Dai)是擔(dān)子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬真菌[1,2]，為我國名貴傳統(tǒng)中藥材，已有2 000多年的應(yīng)用研究歷史，最早《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為靈芝具有益氣強(qiáng)身、扶正固本、延年益壽等功效，現(xiàn)代研究表明靈芝主要活性物質(zhì)有多糖、三萜類、甾醇類、氨基酸、核苷、蛋白質(zhì)等[3]，其中靈芝多糖是最主要的藥效成分[4-6]，目前已經(jīng)從不同來源的靈芝材料中分離獲得200多個(gè)多糖組分，其中大部分為葡聚糖，單糖主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖等[7,8]。大量的臨床試驗(yàn)表明靈芝多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖、抗菌解毒等作用[9-13]。

近年來靈芝的研究越來越熱，人們對野生靈芝資源的需求不斷增大，導(dǎo)致野生資源越來越匱乏，而野生靈芝品種的馴化研究是資源利用中重要的一環(huán)。在這種形勢下，對靈芝野生資源種類的正確認(rèn)識以及活性研究有著積極的意義，目前，雖然對海南島野生靈芝的研究已有一些報(bào)道[14,15]，但是研究集中在資源分類和分離馴化，還沒有對海南島野生靈芝子實(shí)體多糖的組成和活性研究的報(bào)道。本研究首先對三株海南野生靈芝子實(shí)體進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定；其次通過HPLC分析了子實(shí)體多糖的單糖組成；最后測定多糖的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力進(jìn)行抗氧化活性評價(jià)。鑒定海南島的野生靈芝資源和深入研究其活性是重要的基礎(chǔ)工作，本研究以期為海南島野生靈芝資源的保護(hù)利用或深入研究其多糖活性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

樣品采集于海南島五指山國家級自然保護(hù)區(qū)，三株靈芝分別編號為HN-1、HN-2和HN-3。

1.1.2 試劑

三氟乙酸(TFA)、乙酸銨、乙腈(Merck，德國)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)分析純(Sigma，美國)、DNA提取試劑盒(OMEGA公司的D3390-02 E.Z.N.A.TM Fungal DNA Kit 試劑盒)、葡萄糖(Glc，≥98%)、D-木糖(Xyl，98%)、D-半乳糖(Gal，≥99%)、D-甘露糖(Man，≥98%)、核糖(Rib，>98%)、D-鼠李糖(Rha，≥98%)等標(biāo)準(zhǔn)品(成都普思生物科技股份有限公司)，其他試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.3 儀器

紫外分光光度計(jì)(Molecular Devices美國)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Eyelaosb 2000日本)，冷凍干燥機(jī)(CHRIST Beta 2-8 LSCplus德國)，高效液相色譜儀(Perkinelmer CT 06484美國)，全波長掃描酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取、擴(kuò)增及測序

將子實(shí)體表面用無菌水清洗干凈，取2 g子實(shí)體用液氮研磨，采用試劑盒提取DNA，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[16]，擴(kuò)增樣品送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 靈芝子實(shí)體粗多糖的提取將

靈芝子實(shí)體于60 ℃下烘干，粉碎。稱取50.0 g靈芝子實(shí)體粉末，按料液比1∶30(W/V)加入蒸餾水，90 ℃水浴提取3 h，提取2次，合并濾液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約30 mL，經(jīng)過3 000 Da膜過濾，向溶液中加入其體積1/3的Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇)=4∶1)混合震蕩后靜置30 min，5 000 rpm，離心10 min，除去有機(jī)層及水層和有機(jī)層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)多次至無蛋白質(zhì)產(chǎn)生。除蛋白后的多糖，再經(jīng)過95%酒精醇沉，最后5 000 rpm離心10 min去上清，冷凍干燥保存，多糖含量采用苯酚-硫酸法測定[17]。

1.2.3 混合單糖標(biāo)樣的衍生

單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與靈芝多糖按Feng等[18]的方法并做改進(jìn)，進(jìn)行柱前衍生化后進(jìn)行HPLC分析；其中單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為D-甘露糖(D-mannose，Man)、D-木糖(D-xylose，Xyl)、L-鼠李糖(L-rhamnose，Rha)、D-葡萄糖(D-glucose，Glc)、D-半乳糖(D-galactose，Gal)、核糖(ribose，Rib)、D-阿拉伯糖(D-arabinose，arab)、L-巖藻糖(L-fucose，F(xiàn)uc)標(biāo)準(zhǔn)品，分別配成5 mg/mL，同等體積混合。分別取300 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液與300 μL 0.6 mol/L NaOH溶液，置于2 mL的離心管中并混合均勻；再取150 μL的混合液于5 mL的具塞刻度試管中，加150 μL 0.5 mol/L的PMP(0.435 5 g/5 mL)甲醇溶液，漩渦混勻；在70 ℃烘箱中反應(yīng)120 min；取出放置10 min冷卻至室溫；加150 μL 0.3 mol/L的HCl中和；再加水至3 mL，再加等體積的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.2 μm微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析。

1.2.4 多糖衍生樣品制備

吸取300 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的多糖樣品溶液于5 mL的具塞刻度試管中，加入300 μL的4 mol/LTFA，充N2封管，110 ℃烘箱中水解70 min；取出室溫放置10 min，冷卻后打開蓋，加600 μL甲醇后用N2吹干，如此重復(fù)加甲醇并用N2吹3次，去除溶液中的TFA；再加入150 μL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解殘?jiān)?，再?50 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻，同樣在70 ℃的烘箱中反應(yīng)120 min，冷卻后按“1.2.3”進(jìn)行中和和萃取，最后用0.2 μm微孔膜過濾。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽(pH 6.7)，緩沖液-乙腈，體積比為83∶17；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：50 μL。

1.2.6 靈芝多糖對DPPH的清除作用

參照Feng[18]和Feng[19]的方法，略作修改。稱取一定質(zhì)量的粗多糖，分別配成不同質(zhì)量濃度(0、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL)的粗多糖水溶液各10 mL。各取0.5 mL的樣品，分別加入0.5 mL 0.04 mg/mL的DPPH的乙醇溶液，在振蕩器上混勻30 s，后放入25 ℃烘箱中避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀517 nm處測定其吸光值(A)?？瞻捉M用0.5 mL去離子水代替樣品，對照組用0.5 mL無水乙醇溶液，陽性對照為不同濃度的維生素C。三次重復(fù)取平均值。

式中：A空白為空白組吸光值；A對照為對照組吸光值；A樣品為樣品組吸光值，下同。

1.2.7 對羥基自由基的清除作用

參照Zhang[20]和Ma等[21]方法，進(jìn)行了部分修改。分別取1.2.6方法中配制好的不同質(zhì)量濃度的多糖溶液1 mL于試管中，向各管中加入新鮮配制的硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)和水楊酸溶液(6 mmol/L)各0.3 mL，在振蕩器上混勻30 s，之后加入0.1%的過氧化氫溶液0.3 mL，繼續(xù)振蕩混勻30 s，37 ℃烘箱中反應(yīng)30 min，酶標(biāo)儀510 nm處測定吸光值?？瞻捉M以去離子水代替多糖樣品，陽性對照為不同濃度的Vc。三次重復(fù)取平均值

1.2.8 對超氧陰離子的清除作用

參照Ma[21]和Han[22]的方法，進(jìn)行適當(dāng)修改。選取10 mL的具塞試管，向各管中加入50 mmol/L pH為8.2的磷酸鹽緩沖液0.9 mL，在25 ℃烘箱中靜置30 min，再向各試管中加入0.2 mL“1.2.6”中配制好的不同質(zhì)量濃度的多糖樣品，然后加入25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.08 mL，振蕩器上混勻30 s，25 ℃烘箱中避光反應(yīng)10 min，再加入濃度為80 mmol/L的HCl 0.2 mL，水浴搖床反應(yīng)5 min，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm，然后在酶標(biāo)儀420 nm處測定吸光度值。空白組以去離子水代替多糖樣品，對照組為80 mmol/L HCl代替鄰苯三酚，陽性對照為不同濃度的Vc。三次重復(fù)取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 野生靈芝形態(tài)鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將HN-1、HN-2和HN-3子實(shí)體樣品的ITS測序序列上傳NCBI，分別獲得序列號MK968730、MK968731、MK968732，同時(shí)將其測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，同時(shí)在GenBank中尋找同源性最大的序列，每個(gè)樣品各找4條與之對應(yīng)相似的同源序列(相似度≥99%)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)以假芝(Amaurodermasubrugosum)為外參。從圖1中可以看出，HN-1、HN-2和HN-3都屬于靈芝種，但處于不同的分支上，與赤芝(G.lingzhi)距離較遠(yuǎn)。HN-1與KT318604.1(G.sinense)相似度非常高，相似性≥99%；HN-2與KT318590.1(G.australe)相似度≥99%；HN-3與JX840350.1(G.mastoporum)相似度≥99%。

三株野生靈芝子實(shí)體性狀和生境見表1，三株野生靈芝子實(shí)體形態(tài)圖(見圖2)，通過ITS序列分析和形態(tài)鑒定，可確定HN-1為紫芝(G.sinense)，HN-2為南方靈芝(G.australe)，HN-3為無柄紫靈芝(G.mastoporum)。

表1 三株野生靈芝子實(shí)體性狀和生境

續(xù)表1(Continued Tab.1)

樣品SampleHN-1HN-2HN-3菌蓋背面Back純白色,能看到細(xì)小的微孔白色,有微孔但不明顯褐色,較光滑菌柄長度Length of stipe(cm)菌柄較細(xì)長18.5無菌柄無菌柄菌柄形狀Stipe shape紫褐色,光滑無菌柄無菌柄菌肉顏色、味道Color and taste of mushroom meat褐色,無苦味新鮮菌肉淺褐色,木栓質(zhì),干燥后變?yōu)樯詈稚?苦味較濃菌肉暗褐色,木栓質(zhì),微苦味生境Habitat混交林里,以闊葉樹、竹子為主,潮濕生長在活榕樹上,所生長地位為斷枝處,有一個(gè)狹窄的柄基生長在臥倒的腐木上相似物種Similar species紫芝(G.sinense)南方靈芝(G.australe)無柄紫靈芝(G.mastoporum)

2.2 多糖含量及多糖電鏡分析

表2為三種靈芝子實(shí)體的多糖提取率數(shù)據(jù)，從表中可以看出HN-1的多糖提取率最高，為2.39%±0.05%，其次為HN-3，最低的為HN-2，三者之間的多糖提取率存在顯著差異(P<0.05)。

將干燥后的多糖放大50倍電鏡掃描，圖3為HN-1、HN-2和HN-3的多糖電鏡掃描結(jié)果。目前，對于多糖表面結(jié)構(gòu)的表征，還沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但電鏡掃描結(jié)果可顯示樣品的部分表面結(jié)構(gòu)，從中可以比較不同樣品間多糖結(jié)構(gòu)的差異?？捎^測到HN-1和HN-2多糖能較好的均勻分散開，呈現(xiàn)塊狀，塊狀中均存在空洞和凹槽，而HN-3同樣呈現(xiàn)塊狀，但不能較好的分散開，塊狀較致密；HN-1的塊狀多糖部分表面光滑、部分表面出現(xiàn)絨毛狀，HN-2的塊狀多糖表面大部分為絨毛狀、小部分表面光滑，而HN-3的塊狀多糖大部分表面光滑，只有斷裂處出現(xiàn)少量絨毛。可見，三種多糖組分表面結(jié)構(gòu)存在一定的差異。

圖2 3種野生靈芝形態(tài)圖Fig.2 three species of wild Ganoderma 注：A-1：HN-1正面，A-2：HN-1背面；B-1 HN-2正面：B-2：HN-2背面；C-1 HN-3正面：C-2：HN-3背面。Note:A-1:HN-1 front,A-2:HN-1 back;B-1 HN-2 front:B-2:HN-2 back;C-1 HN-3 front:C-2:HN-3 back.

表2 多糖提取率

注：不同小寫字母表示不同靈芝多糖含量間具有顯著差異(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters indicate significant differences between differentGanodermapolysaccharide contents (P<0.05),the same below.

圖3 靈芝多糖掃描電鏡(50×)Fig.3 Ganoderma polysaccharide scanning electron microscope (50 ×).注：A：靈芝HN-1，B：靈芝HN-2，C：靈芝HN-3。Note:A：HN-1，B：HN-2，C：HN-3.

2.3 靈芝多糖的單糖組成

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的PMP衍化分析

將各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)樣衍生化，并進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP衍生物實(shí)現(xiàn)了良好的分離。

2.3.2 各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系

分別各取單糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液10、25、50、100、150 μL稀釋至500 μL進(jìn)行HPLC分析。根據(jù)各單糖的質(zhì)量濃度對應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回歸分析，進(jìn)而獲得各單糖的回歸方程。結(jié)果表明，8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均較好，結(jié)果如表3。

2.3.3 靈芝多糖組分的水解產(chǎn)物PMP衍生物分析

同單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的色譜圖進(jìn)行對照分析，HN-1多糖含有甘露糖、木糖和鼠李糖；HN-2多糖含有甘露糖和葡萄糖；HN-3多糖含有甘露糖、木糖和葡萄糖(見圖5)。

通過對照標(biāo)準(zhǔn)單糖的線性回歸方程，可以計(jì)算樣品中各單糖的摩爾比，具體數(shù)據(jù)見表4。三株海南野生靈芝子實(shí)體其多糖的單糖組成都不相同，但都含有相同的甘露糖成分。

圖4 8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物高效液相色譜圖Fig.4 HPLC of eight monosaccharide standard mixtures注：1：甘露糖；2：木糖；3：鼠李糖；4：葡萄糖；5：半乳糖；6：核糖；7：阿拉伯糖；8：巖藻糖。Note：1:Mannose;2:Xylose;3:Rhamnose;4:Glucose;5:Galactose;6:Ribose;7:Arabinose;8:Fucose.

2.4 多糖抗氧化活性分析

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力

以VC作為陽性對照，三株海南野生靈芝多糖(HN-1、HN-2、HN-3)對DPPH的清除能力均隨其濃度的升高而增大(圖6)，在濃度和清除率之間有著良好的正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)多糖濃度為0.25 mg/mL時(shí)，三株靈芝多糖清除率均在35%左右，隨著濃度的逐漸上升，HN-1多糖的清除率明顯高于其他兩組；當(dāng)多糖濃度達(dá)到5 mg/mL，HN-1的清除率為84.68%，HN-2為76.36%，HN-3為81.68%，但仍顯著低于Vc(P<0.05)；IC50值越小，其抗氧化活性的能力越好，從下表5的IC50值可以看出，HN-1的IC50值最小，其清除DPPH能力最強(qiáng)，其次為HN-3和HN-2的清除DPPH能力最低。

表3 8種單糖的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

表4 靈芝多糖單糖組成及摩爾比

圖5 三種靈芝多糖高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatogram of three kinds of Ganoderma polysaccharides注：A(HN-1)，1：甘露糖，2：木糖，3：鼠李糖；B(HN-2)，1：甘露糖，2：葡萄糖；C(HN-2)，1：甘露糖，2：木糖，3：葡萄糖。Note:A(HN-1),1:Mannose,2:Xylose,3:Rhamnose;B(HN-2),1:Mannose,2:Glucose;C(HN-2),1:Mannose,2:Xylose,3:Glucose.

圖6 不同靈芝多糖對DPPH的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of different Ganoderma polysaccharides on DPPH

2.4.2 對羥基自由基的清除能力

三株野生靈芝子實(shí)體多糖清除·OH-的活性與多糖濃度存在不同程度的依賴關(guān)系，見圖7。在多糖質(zhì)量濃度為0.25和0.5 mg/mL時(shí)，三種靈芝多糖對·OH-的清除率差異較小，處在28%～35%之間，清除率大小順序?yàn)镠N-1>HN-3>HN-2；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1時(shí)，清除率都顯著上升，HN-3的清除率最高，達(dá)到了66.34%，而HN-1和HN-2的清除率基本相同；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度分別為2和5 mg/mL時(shí)，HN-1的清除率升高幅度明顯大于HN-1和HN-3，清除率順序都為HN-1>HN-3>HN-2。從下表5中可以看出，HN-1和HN-3的IC50值不存在顯著差異(P>0.05)，說明HN-3和HN-1對·OH-的清除能力顯著優(yōu)于HN-2(P<0.05)。

2.4.3 對超氧陰離子的清除能力

三種靈芝子實(shí)體多糖對超氧自由基清除活性同樣隨著多糖質(zhì)量濃度的提高而增加(圖8)，當(dāng)多糖濃度從0.25 mg/mL提高到2 mg/mL時(shí)，HN-1、HN-2和HN-3的清除率都顯著上升，當(dāng)多糖濃度從2 mg/mL提高到5 mg/mL時(shí)，三種多糖的清除率升高幅度較小。從表5中可以看出，HN-1、HN-2和HN-3的IC50相互間存在顯著差異(P<0.05)，HN-1的IC50最低，其對超氧自由基清除活性顯著高于其他兩種多糖。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5.0 mg/mL時(shí)，HN-1的清除率為78.62%，HN-2的清除率為69.54%，HN-3的清除率為72.35%，但仍顯著低于Vc。

圖7 不同靈芝多糖對羥基自由基的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of different Ganoderma polysaccharides on hydroxyl radica

3 討論

3.1 野生靈芝的鑒定分析

海南島屬于熱帶和亞熱帶雨林氣候，其獨(dú)特的氣候優(yōu)勢為野生靈芝生長提供了適宜的溫度和濕度，同時(shí)豐富的原始森林為靈芝生長提供了充足的營養(yǎng)。目前，海南島已記載有分布的靈芝屬資源達(dá)78種之多[15]，其中野生靈芝資源有28種[23,24]，是我國野生靈芝分布最豐富的地區(qū)之一，本研究對采集于海南島的三株野生靈芝進(jìn)行了形態(tài)鑒定和分子鑒定，HN-1鑒定為紫芝(G.sinense)，HN-2鑒定為南方靈芝(G.australe)，HN-3鑒定為無柄紫靈芝(G.mastoporum)，三株野生靈芝的鑒定結(jié)果同Wen[15]對采集于海南島的7種野生靈芝的形態(tài)與分子鑒定結(jié)果相似。

表5 不同多糖對自由基清除的半抑制濃度

圖8 不同靈芝多糖對超氧陰離子的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of different Ganoderma polysaccharides on superoxide anion

3.2 靈芝多糖的單糖組成差異分析

多糖是靈芝主要活性成分之一，多糖的分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象常常攜帶著大量的生物學(xué)信息，在生物體的中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它是由單一或多種單糖聚合而成的高分子化合物。大量學(xué)者對靈芝多糖的單糖組成和含量進(jìn)行了研究，Yang等[25]從靈芝子實(shí)體中分離得到2個(gè)多糖組分，且其單糖組成存在較大的差異；Zhang[26]對不同靈芝孢子粉的多糖組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其單糖組成主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖組成，各單糖含量存在顯著差異；Xu[27]研究發(fā)現(xiàn)多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖組成，同時(shí)表明多糖的抗氧化活性與單糖組成存在密切相關(guān)，另外還有研究發(fā)現(xiàn)靈芝子實(shí)體中多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成，而菌絲體和孢子粉中多糖的單糖組成主要為葡萄糖[28]，通過熱水浸提法提取的靈芝子實(shí)體多糖由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖組成，而通過堿抽提法得到的靈芝多糖則為葡聚糖[29]。本研究通過熱水浸提法提取野生靈芝子實(shí)體部位的靈芝多糖，結(jié)果顯示多糖表征存在一定的差異，各單糖組成和含量同樣存在較大差異。對于靈芝多糖的單糖組成差異較大，部分學(xué)者對出現(xiàn)這一差異的原因進(jìn)行過研究[30-32]，發(fā)現(xiàn)靈芝種類的不同、產(chǎn)地不同、靈芝部位不同以及提取多糖方法的不同，都會(huì)導(dǎo)致靈芝多糖在化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成上有較大的多樣性。

3.3 靈芝多糖的抗氧化活性分析

多糖結(jié)構(gòu)特征包括單糖組成及含量、主鏈結(jié)構(gòu)、分子量大小、糖苷鍵構(gòu)型等，靈芝多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)差異很大，對其生物活性具有很大影響，尤其是單糖組成和主鏈結(jié)構(gòu)。大量體外抗氧化試驗(yàn)證實(shí)，從靈芝中分離提取出多糖具有顯著抗氧化活性。本研究提取的3株野生靈芝子實(shí)體多糖同樣具有較高的清除自由基能力，在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，相同濃度下，HN-1多糖的抗氧化能力大于HN-3，HN-2最弱，這可能是由于各多糖的單糖組成及含量的差異變化引起，HN-1和HN-3多糖都由三種單糖組成且都含有木糖，HN-2則只由兩種單糖組成。Liao[33]曾研究發(fā)現(xiàn)富含巖藻糖的靈芝多糖具有更好的免疫調(diào)節(jié)作用，Ni[34]在分析多糖的單糖組成與活性的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)多糖的抗氧化能力與多糖的單糖組成有著較大相關(guān)性關(guān)系，其含有木糖的多糖樣品其抗氧化活性明顯較高。還有一些研究表明，多糖的抗氧化能力與多糖的單糖組成、分子量有較大關(guān)系[35]。較多單糖組成以及較高含量的木糖可能是決定靈芝子實(shí)體多糖具有較高的抗氧化活性的原因之一，本文僅限對于靈芝子實(shí)體多糖的單糖組成展開研究，而未對多糖進(jìn)行純化以及深入研究多糖的具體結(jié)構(gòu)，在今后的試驗(yàn)中將會(huì)更深入研究多糖的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和多糖發(fā)揮自身抗氧化作用的機(jī)制。

4 結(jié)論

海南島的野生靈芝特點(diǎn)顯著，可作為靈芝馴化栽培和品種改良的重要材料，采集于海南島的三株野生靈芝子實(shí)體多糖的單糖組成及單糖含量具有一定差異，HN-1多糖主要由甘露糖、木糖、鼠李糖組成，其摩爾比為1∶0.29∶0.14，HN-2多糖主要由甘露糖、葡萄糖組成，其摩爾比為1∶1.7，HN-3多糖主要由甘露糖、木糖、葡萄糖組成，其摩爾比1∶1.98∶1.8。另外，三株靈芝的多糖都具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力都隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而提高，HN-1的抗氧化活性最強(qiáng)，其次是HN-3和HN-2的抗氧化活性最弱。通過對海南島野生靈芝資源鑒定、子實(shí)體多糖的單糖組成和抗氧化活性研究，為靈芝資源的保護(hù)利用以及相關(guān)的科學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考，為后續(xù)海南島野生靈芝馴化后人工栽培子實(shí)體多糖的產(chǎn)品開發(fā)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。