艾 婷 周 軍

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 超聲科，湖北 宜昌 443003)

建立合適的乳腺癌動物模型對研究人類乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等具有重要意義。目前，乳腺癌動物模型多樣，包括自發(fā)性乳腺癌模型、轉(zhuǎn)基因乳腺癌模型、誘發(fā)性乳腺癌模型和移植乳腺癌模型。每種動物模型的建立都有相應(yīng)的適用條件及優(yōu)缺點。最常用的實驗動物腫瘤模型為移植性，其周期短，成本低，形成腫瘤類型單一，且瘤體生長速度較為一致，成功率可達到100%[1]。超聲己廣泛用于乳腺癌的篩查及診斷，不僅能觀察腫瘤的形態(tài)學(xué)特征，也能動態(tài)評估腫瘤內(nèi)新生血管的發(fā)生發(fā)展過程[2]。因此，本文采用SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞株植入雌性SD乳鼠腋窩皮下組織，建立大鼠乳腺癌移植瘤模型。造模成功后用超聲觀察移植瘤形態(tài)學(xué)及血流動力學(xué)特征，并與人乳腺癌進行對比分析，為人乳腺癌的超聲影像學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和瘤株

雌性SD幼鼠(清潔級)由三峽大學(xué)實驗動物中心提供，7日齡。SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)，戊巴比妥鈉(上海源葉生物科技有限公司)。美國飛利浦公司iU22智能超聲成像儀，容積探頭頻率為5～12 MHz，實驗過程中超聲顯像深度、scale、TGC等均保持不變。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，隔天換液，2～3 d傳代。

1.2.2 動物模型的建立

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用無血清的培養(yǎng)液稀釋成1×107個/mL，取0.2 mL注入雌性SD大鼠右腋窩皮下，并用棉簽局部壓迫1 min，防止懸液漏出。每日對大鼠的成瘤情況進行觀察，測量瘤體的最大直徑。

1.2.3 超聲掃查

采用美國飛利浦公司生產(chǎn)的iU22超聲診斷儀，應(yīng)用線陣容積探頭，探頭頻率為5～12 MHz，檢查前首先用硫化鈉脫去種植部位體毛，2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定后對移植瘤進行多切面掃查，首先應(yīng)用二維超聲多切面觀察腫瘤的生物學(xué)特征，如腫瘤大小、形態(tài)、邊界、內(nèi)部回聲，然后行彩色多普勒檢查，觀察腫瘤的血流動力學(xué)特征。

1.2.4 病理學(xué)觀察

超聲檢查結(jié)束后斷頸處死全部荷瘤大鼠，切取所有腫瘤組織，然后用10%中性福爾馬林固定腫瘤組織，石蠟包埋，行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長情況

瘤細(xì)胞接種當(dāng)天，大鼠局部皮下可見由瘤細(xì)胞懸液形成的液泡，次日液泡吸收，局部變平整。接種5 d后可觸及皮下結(jié)節(jié)，其后瘤體生長迅速，接種3 w后瘤體可增大至約1.5 cm×1.0 cm，最大腫瘤長徑為5.0 cm，成瘤率100%(見圖1)。

2.2 超聲聲像圖特點

早期腫瘤為類圓形，呈低回聲，形態(tài)尚規(guī)則，內(nèi)部回聲尚均，與周邊正常組織分界清晰，彩色多普勒顯示腫瘤內(nèi)部血流信號稀少(見圖2A)。3 w后腫瘤體積迅速增大，內(nèi)部回聲不均呈混合回聲，部分可見液化壞死區(qū)，形態(tài)不規(guī)則，與周圍組織分界不清，彩色多普勒顯示腫塊內(nèi)部及周邊見較豐富血流信號(見圖2B)。

2.3 病理學(xué)觀察

荷瘤大鼠全部存活。3 w時斷頸處死大鼠，取腫瘤行病理學(xué)檢查。大體觀腫塊成蒼白色，多呈橢圓形，邊緣呈分葉狀改變，質(zhì)地較硬，腫瘤血管較豐富(見圖2C)。鏡下觀腫瘤細(xì)胞大小形態(tài)不一，核大深染，可見瘤巨細(xì)胞及多倍體細(xì)胞，核分裂相易見，異型性明顯(見圖2D)。

3 討論

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，在西方發(fā)達國家已成為女性的第一位死亡原因[3]。因此，建立有效的動物模型及可靠的評價方法，對研究乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和治療具有重要意義。理想的腫瘤動物模型要求致癌方法簡單、易行、重復(fù)性好，指標(biāo)客觀、明確，病理類型、生物學(xué)行為及組織化學(xué)改變等方面與人類腫瘤一致[4,5]。

目前，乳腺癌動物模型種類較多，包括自發(fā)性、轉(zhuǎn)基因性、誘發(fā)性和移植性乳腺癌模型[6]。誘發(fā)性乳腺癌模型與人體腫瘤較為相似，腫瘤生長速度較慢，瘤細(xì)胞增殖比率低，倍增時間長。但該模型致癌物的誘癌過程需時較長，成功率難以達到100%，且所誘導(dǎo)出的腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征多樣，易形成多發(fā)性腫瘤[7]。與以上三者相比，移植性乳腺癌模型周期短，成本低，形成腫瘤類型單一，且瘤體生長速度較為一致，成功率可達到100%。此方法所獲得的腫瘤易于觀察對照，可在實驗動物中連續(xù)移植，便于長期研究和成果交流。

以往建立大鼠乳腺癌模型使用細(xì)胞株為Walker-256，其所形成的腫瘤具有部分肉瘤性質(zhì)，血供豐富[8]。而人乳腺癌細(xì)胞所形成的腫瘤大部分不具肉瘤性質(zhì)，且腫瘤血供豐富程度不一。SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞是用7,12-二甲基苯蒽誘導(dǎo)雌性SD大鼠形成乳腺癌后，于體外分離培養(yǎng)而獲得[9]。SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞大多數(shù)呈上皮細(xì)胞樣，生物學(xué)特性穩(wěn)定，具備惡性腫瘤細(xì)胞快速生長的特點，移植到同源動物可以成活，接種到同種大鼠體內(nèi)可以致瘤，是研究腫瘤特性的良好體外實驗?zāi)Ｐ蚚10]。與Walker-256細(xì)胞相比，SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞與人乳腺癌細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)及生物學(xué)行為更為接近，且成瘤率高(可達100%)，成模時間短，實驗成本低。因此，本實驗選擇使用SHZ-88細(xì)胞懸液進行大鼠腋下接種。

超聲檢查具有實時性、便捷性，已被廣泛應(yīng)用于乳腺良惡性病變的篩查及診斷。且隨著超聲技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，超聲在乳腺癌的診斷中扮演著越來越重要的角色[11,12]。二維超聲可以反映惡性腫瘤的部分形態(tài)學(xué)特征，如內(nèi)部回聲、形態(tài)及鈣化情況，彩色多普勒可以反映出病灶中的血流動力學(xué)特征，如腫瘤內(nèi)部的不規(guī)則穿支血流及血流豐富程度等[13]。本研究中隨著大鼠皮下移植瘤的體積變化，二維超聲觀察到腫瘤內(nèi)部回聲從均勻到不均勻直至內(nèi)部出現(xiàn)液化壞死區(qū)的變化過程，彩色多普勒顯示腫瘤內(nèi)血流信號由稀少到逐漸豐富的動態(tài)過程，這符合人類乳腺癌超聲表現(xiàn)的演變過程。因此，從本研究制備荷SHZ-88的大鼠乳腺癌模型可以獲得體積較大的腫瘤，成瘤后的自然消退率也比較低，且聲像圖特征和病理特征與人乳腺癌相似，是研究乳腺癌超聲影像的適合移植瘤模型。

綜上所述，應(yīng)用瘤細(xì)胞懸液移植法可有效建立SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞皮下移植瘤模型，成瘤率高、周期短、實驗成本低，且其所攜帶的瘤體大小適中，是較理想的用于乳腺癌超聲影像學(xué)研究的動物模型。