肖典冰

(泗涇醫(yī)院 上海 201601）

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床菌株 收集2018年1月—2018年10月期間，從本院患者臨床無菌部位標(biāo)本中分離的65株念珠菌。

1.1.2 質(zhì)控菌株 ATCC 90028白色念珠菌、ATCC22019近平滑假絲酵母菌為質(zhì)控菌珠。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)鑒定 標(biāo)本按常規(guī)方法培養(yǎng)、分離，沙保羅平板上純培養(yǎng)、經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，轉(zhuǎn)種假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定，顯綠色，翠綠色的是白色念珠菌;藍(lán)灰色，鐵藍(lán)色的是熱帶念珠菌；粉紅色，模糊有菌毛菌落較大的是克柔念珠菌；紫色的是光滑念珠菌。

1.2.2 儀器鑒定 顯色培養(yǎng)基上為白色菌落或顯色不清楚的念珠菌，取純培養(yǎng)物用法國生物梅里埃YST鑒定卡在VITEKII全自動微生物分析儀上進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株：白假絲酵母菌ATCC90028、近平滑假絲酵母菌ATCC22019。

1.2.3 特異性PCR檢測 所有收集的菌株都用PCR擴增的方法進(jìn)行最終鑒定。

1.2.3.1 念珠菌基因組DNA提取 玻璃珠振蕩法提取念珠菌屬DNA；（1）準(zhǔn)備高壓過的1.5ml EP管；（2）每支EP管內(nèi)分裝約50μl的玻璃珠；（3）向分裝好玻璃珠的EP管內(nèi)加入300μl～500μl雙蒸水；（4）編號，使用1μl一次性接種環(huán)，從三區(qū)挑取分純的大菌落3～4個或小菌落7～8個，在EP管中充分研磨，最終濁度控制在1.0～2.0McF之間，切勿過稀或過濃；（5）將蓋好蓋的EP管在振蕩器上振蕩30s(隱球菌60s)；（6）EP管100℃水浴/金屬浴15min；（7）將水浴后的EP管置于-80℃ 1～2min，待蒸汽沉降后13,200轉(zhuǎn)離心5min；（8）取新EP管編號；（9）從離心后的EP管中小心吸取上清液200～250μl左右移入新EP管中，棄去舊管；（10）將提取的DNA置于4℃進(jìn)行保存。

1.2.3.2 PCR擴增體系Mix 12.5μL,ITS-1(F)0.1μL,ITS-4(R)0.1μL,DNA2μL,ddH2O,9.3μL。

1.2.3.3 PCR反應(yīng)條件及電泳檢測 將Eppendorf管放入PCR儀，蓋好管蓋，設(shè)定PCR條件。擴增條件為：94℃10min,,94℃30sec,50℃30sec,72℃60sec,72℃10min，30個循環(huán)。

1.2.3.4 DNA片段測序及序列對比： 所得序列使用Blastn與CBS真菌多樣性研究中心醫(yī)學(xué)真菌數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列(http://www.cbs.knaw.nl/databases)進(jìn)行比對，并結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，即可準(zhǔn)確鑒定至屬的水平。

1.2.4 真菌藥敏 真菌藥敏測定按試劑說明書操作，主要步驟有制備菌懸液、接種標(biāo)本并加樣、礦物油封蓋、35℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。注意設(shè)立陰性對照孔和陽性對照孔。

2.結(jié)果

2.1 65株念珠菌的分類

顯色方法結(jié)合儀器鑒定的結(jié)果顯示在臨床無菌部位標(biāo)本中分離65株無菌部位念珠菌中，白色念珠菌28株（43.1%）,光滑念珠菌15株（23.1%）,隱球菌10株（15.4%），近平滑念珠菌5株（7.7%），無名假絲酵母菌3（4.6%），葡萄牙假絲酵母菌2（3.1%），熱帶念珠菌1株（1.5%），克柔念珠菌1株（1.5%），見表1。

表1 65株念珠菌的分類

PCR鑒定的結(jié)果顯示在臨床無菌部位標(biāo)本中分離65株無菌部位念珠菌中白色念珠菌27株（41.5%）,光滑念珠菌10株（15.4%）,隱球菌10（15.4%），近平滑念珠菌7（10.8%），熱帶念珠菌5株（3.0%），無名假絲酵母菌3（4.6%），葡萄牙假絲酵母菌2（3.1%），克柔念珠菌1株（1.5%）,見表2。

表2 65株念珠菌的分類

2.4 藥敏試驗結(jié)果

ATB FUNGUS 3真菌藥敏測定試劑盒（微量稀釋法）法結(jié)果顯示在65株念珠菌中，兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和氟康唑等四種藥物對白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、隱球菌、近平滑念珠菌、無名假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌、表現(xiàn)出較強的敏感性。兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶對克柔念珠菌表現(xiàn)出較強的敏感性。氟康唑?qū)饣钪榫拿舾行暂^差，敏感率為84.5%?？巳崮钪榫鷮Ψ颠虮憩F(xiàn)出很高的耐藥性，耐藥率為65.5%。伊曲康唑?qū)δ钪榫鷮俚拿舾行暂^差。見表3、4。

表3 65株念珠菌的藥敏結(jié)果（%）

表4 65株念珠菌的藥敏結(jié)果（%）

3.討論

引起深部真菌感染的主要有念珠菌、隱球菌、曲霉、毛霉等，其中以念珠菌感染比較常見，主要包括白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌等等。其中以白色念珠菌為最常見的致病菌。當(dāng)機體發(fā)生正常菌群失調(diào)或抵抗力下降時，可引起皮膚念珠菌病、粘膜念珠菌病、內(nèi)臟及中樞神經(jīng)念珠菌病[1]。在本組資料中，顯色方法結(jié)合儀器鑒定的結(jié)果顯示在臨床無菌部位標(biāo)本中分離65株無菌部位念珠菌中，白色念珠菌28株（43.1%）,光滑念珠菌15株（23.1%）,近平滑念珠菌5（7.7%），無名假絲酵母菌3（4.6%），葡萄牙假絲酵母菌2（3.1%），熱帶念珠菌1株（1.5%），克柔念珠菌1株（1.5%），PCR鑒定的結(jié)果顯示在臨床無菌部位標(biāo)本中分離65株無菌部位念珠菌中白色念珠菌27株（41.5%）,光滑念珠菌10株（15.4%）,隱球菌10株（15.4%），近平滑念珠菌6（9.2%），熱帶念珠菌5株（3.0%），無名假絲酵母菌3（4.6%），葡萄牙假絲酵母菌2（3.1%），克柔念珠菌1株?？梢姛o菌部位的念珠菌感染仍然以白色念珠菌為主，但是白色念珠菌感染所占的比例明顯低于之前68.6% 的報道。

PCR方法結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6株菌株與念珠菌顯色培養(yǎng)基結(jié)合儀器鑒定的結(jié)果兩者不符，1株菌株顯色結(jié)果是白色念珠菌，PCR鑒定結(jié)果是熱帶念珠菌。3株菌株顯色結(jié)果是光滑念珠菌，PCR鑒定結(jié)果是熱帶念珠菌。2株菌株顯色結(jié)果是光滑念珠菌，PCR鑒定結(jié)果是近平滑念珠菌。這是因為顯色方法對于顏色判斷具有主觀因素，特別是顏色本身就不明顯時，判斷容易出現(xiàn)錯誤。但是PCR是通過特異性的擴增ITS片段并對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，特異性與準(zhǔn)確性較高，最終還是以PCR結(jié)果可靠。

伏立康唑被證實對念珠菌屬具有良好的活性,其MIC值<0.1125mg/L有試驗發(fā)現(xiàn)伏立康唑抗白念珠菌和熱帶念珠菌的活性比氟康唑高8倍[2]。因此，本此實驗在利用ATB FUNGUS 3真菌藥敏測定試劑盒（微量稀釋法）對5-氟胞嘧啶(5-FC)、兩性霉素B(AMB)、氟康唑（FCA)、伊曲康唑（ITR)、伏立康唑(VRC)進(jìn)行藥敏分析。本文ATB FUNGUS 3結(jié)果顯示兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和氟康唑等四種藥物對白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、隱球菌、近平滑念珠菌、無名假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌、表現(xiàn)出較強的敏感性。兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶對克柔念珠菌表現(xiàn)出較強的敏感性。氟康唑?qū)饣钪榫拿舾行暂^差，敏感率為84.5%。克柔念珠菌對氟康唑表現(xiàn)出很高的耐藥性，耐藥率為65.5%。伊曲康唑?qū)δ钪榫鷮俚拿舾行暂^差。兩性霉素B單獨使用抗真菌活性很強，對深部真菌引起的嚴(yán)重的內(nèi)臟或全身感染的治療效果很明顯。5-氟胞嘧啶抗真菌活性譜較窄,單獨使用容易產(chǎn)生耐藥,據(jù)報道5-氟胞嘧啶與兩性霉素B聯(lián)合使用, 不易產(chǎn)生耐藥性,已取得了一定療效。因此在臨床工作中針對真菌感染及時進(jìn)行真菌培養(yǎng)和藥敏試驗，合理使用抗真菌藥物，以提高治愈率，降低病死率。