吳振強(qiáng) 戴瑞卿 賴寶春 林明輝 王家瑞

摘要? ? 近年來，辣椒枯萎病發(fā)生越來越嚴(yán)重。為了比較感染枯萎病和健康辣椒根際土壤真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的差異，本研究采用Illumina Miseq測序技術(shù)，對漳州3個辣椒種植基地枯萎病典型患病樣地的健康植株和感病植株根際土壤中的真菌18S rRNA基因V4區(qū)片段進(jìn)行高通量測序。結(jié)果表明，感染枯萎病辣椒植株根際土壤真菌群落多樣性低于健康植株。子囊菌門（Ascomycota）為健康與感染枯萎病植株根際土壤的最優(yōu)勢門，豐度分別為18.5%和38.23%。健康和感染枯萎病植株的優(yōu)勢屬為被孢霉菌屬（Mortierella）、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）、鐮刀菌屬（Fusarium）和紅曲霉菌屬（Monascus），感染枯萎病植株的被孢霉菌屬相對豐度顯著低于健康植株，而鐮刀菌屬和紅曲霉菌屬相對豐度顯著高于健康植株。

關(guān)鍵詞? ? 辣椒;枯萎病;根際土壤;高通量測序技術(shù);真菌多樣性

中圖分類號? ? S763.15? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）07-0184-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Fungus? Community? Structure? and? Diversity? of? Rhizosphere? Soil? of? Healthy? and? Fusarium? Wilt? Chilli? Plants

WU Zhen-qiang 1? ? DAI Rui-qing 1? ? LAI Bao-chun 1 *? ? LIN Ming-hui 2? ? WANG Jia-rui 1

（1 Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences of Fujian Province，Zhangzhou Fujian 363005; 2 Anhou Forestry Station of Pinghe Forestry Bureau）

Abstract? ? In recent years，fusarium wilt chilli has become more and more serious.In order to understand the differences of the funguns community structure and diversity of healthy and fusarium wilt chilli plants in rhizosphere soil.The V4 region of the fungus 18S rRNA gene in soil was amplified，and the amplified fragments were sequenced using Illumina MisSeq high-throughput sequencing technology in this paper.The result showed that the funguns community diversity of wilt chilli plants in rhizosphere soil was lower than the healthy.Ascomycota were the dominant phylum in healthy and wilt chilli plants，which relative abundance were 18.5% and 38.23% respectively.The dominant genera in healthy and wilt chilli plants in rhizosphere soil were Mortierella，Pseudogymnoascus，F(xiàn)usarium and Monascus.The relative abundance of Mortierella in wilt chilli plants was lower than healthy plants，but the relative abundance of Fusarium and Monascus was higher than healthy plants.

Key words? ? chilli;fusarium wilt;rhizosphere soil;high-throughput sequencing technology;fungus diversity

辣椒枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）入侵辣椒根系，進(jìn)而引起辣椒的莖和根基部維管束枯萎腐爛，是一種非常典型的真菌性病害[1]。該病原菌的植物寄主分布廣泛，可引起茄類、黃瓜、香蕉、棉花等100多種植物枯萎病的發(fā)生。作物被病原菌侵染后，葉片和莖稈變黃，根系腐爛，植株枯萎，長勢衰弱，嚴(yán)重時枯死[2-3]。隨著我國辣椒種植年限的增加，種植面積逐年擴(kuò)大，復(fù)種指數(shù)不斷提高，土壤中病原菌不斷積累，辣椒枯萎病在全國各地普遍發(fā)生，造成嚴(yán)重的損失，給辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來極大的威脅[4]。雖然辣椒枯萎病已經(jīng)引起眾多研究者的注意，但是由于該病較復(fù)雜，目前尚無有效的防治措施和方法。

根際土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，在促進(jìn)植物生長和維持土壤生態(tài)平衡等過程中起著十分重要的作用，植物與根際微生物相互作用對植物健康及土壤肥力產(chǎn)生不同的影響[5-6]。土壤真菌是土壤微生物的主要成員，土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)換均受到土壤真菌物種組成和數(shù)量變化的影響[7-8]。研究表明，土壤真菌多樣性與土傳病害的發(fā)生及植物健康存在密切關(guān)系[9-10]。陳潔作等[11]研究表明，野果林健康株覆蓋區(qū)表層土壤真菌群落的多樣性高于患病株覆蓋區(qū)土壤。李雪萍[12]研究發(fā)現(xiàn)，青稞根腐類病害的發(fā)生使青稞根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且發(fā)病越嚴(yán)重，與健康青稞植株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異也越大。結(jié)構(gòu)豐富且多樣性高的土壤微生物群體對土傳病害有抑制作用，土傳病害發(fā)生較輕;反之，發(fā)生較重。因此，為了研究和防治土壤傳播疾病，應(yīng)積極從土壤微生物結(jié)構(gòu)和多樣性研究等入手[13]。目前，有關(guān)辣椒感染枯萎病后，其根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化鮮有報(bào)道。高通量測序技術(shù)以其高讀長、精度高、通量高和無偏性的自身優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于微生物的群落多樣性，為研究根際微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性提供了一個新的方向[14-15]。為此，本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，對辣椒感染枯萎病植株與健康植株的根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析，比較辣椒種植基地健康和感染枯萎病辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性，為辣椒枯萎病的防控提供參考依據(jù)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試土樣

本試驗(yàn)所采集的土樣取自福建省3個辣椒種植基地，分別為南靖、平和、漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，采樣地辣椒枯萎病均發(fā)病較重且病癥典型。于同一辣椒種植田塊中同時采集健康和感病的辣椒根際土壤（不易被抖下的土壤視為根際土壤）。去除地上部分后，依次挖主根、須根，采用抖落法采集根際土[16]，每個土樣取5株。土樣過20目篩，裝入采樣袋于-20 ℃條件冷藏待用。

1.2? ? DNA提取

將根際土壤樣品精確稱取200 mg并加入2 mL離心管中，取70%乙醇1 mL加入，然后以10 000 r/min離心3 min，棄上層液。加入1×PBS溶液，振蕩混勻，室溫條件下以10 000 r/min離心3 min，棄上層液體。將離心管倒扣在吸水紙上至管內(nèi)無液體流下，在55 ℃烘箱中處理10 min。對制備好的樣品提取土壤樣品基因組DNA，使用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit。對基因組DNA精確定量，檢測試劑盒選擇用Qubit_2.0 DNA，從而確定適宜DNA量以進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3? ? 基因擴(kuò)增及測序

以樣品DNA為模板，使用Miseq測序平臺的V4區(qū)通用引物（18SV4F：GGCAAGTCTCGGTGCCAG;18SV4F：ACGGTA TCTRATCRTCTTCG）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：模板DNA 量為10～20 ng，加水溶解定容至30 μL;加primer F（10 μmol/L）2 μL;加15 μL 2×Taq master Mix。PCR反應(yīng)程序：于94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性30 s，于45 ℃退火 20 s，于65 ℃延伸 30 s，5個循環(huán);于94 ℃變性20 s，再于55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，對其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測分離，切膠后，用0.6倍的Agencourt AMPure XP磁珠對DNA進(jìn)行純化回收，精確定量回收產(chǎn)物并進(jìn)行測序（Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒）。

1.4? ? 序列數(shù)據(jù)分析

DNA測序平臺使用Illumina Miseq，對測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制（QC），除原始數(shù)據(jù)接頭序列（選用1.2.1 版Cutadapt軟件），然后進(jìn)行序列拼（采用0.9.6版Pear軟件），去除嵌合體和非特異性擴(kuò)增序列（選擇4.2.40版Uchime軟件），通過blastn進(jìn)行同源比對，最終獲得高質(zhì)量DNA序列。對序列進(jìn)行聚類分析（采用5.2.236版Usearch），依據(jù)相似性進(jìn)行劃分，≥97%為同一分類操作單元（OTU），統(tǒng)計(jì)各樣本的OTU數(shù)（R 1.6.16版VennDiagram package），將各樣本獨(dú)有的和共有的OTU數(shù)進(jìn)行Venn作圖。計(jì)算各樣本的Simpson、Chao1、Shannon、Ace指數(shù)（1.30.1版Mother軟件），然后做曲線圖（R軟件），分析樣本微生物群落的Alpha多樣性。對各樣品進(jìn)行物種分類（2.12版RDP classifier軟件），即對RDP分類閾值≥80%的序列進(jìn)行門、綱、目、科、屬各階層分類（Naive Bayesian assignment算法），分析每個樣本各分類層級水平上的群落組成，對物種分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖（R軟件）。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 數(shù)據(jù)質(zhì)控及測序深度

經(jīng)測序分析獲得健康植株和感染枯萎病植株根際土壤真菌的基因序列分別為163 516、188 072條。經(jīng)質(zhì)控和篩選優(yōu)化處理后，感染枯萎病植株最終獲得145 083條優(yōu)質(zhì)序列，序列平均長度為419 bp;健康植株最終獲得140 493條優(yōu)質(zhì)序列，序列平均長度為420 bp。稀釋曲線分析顯示（圖1），當(dāng)序列大于10 000時，隨著測序數(shù)量的增加，Shannon指數(shù)稀釋曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，可用于整個真菌的群落結(jié)構(gòu)。

2.2? ? OTU聚類分析

在97%相似度水平對樣品序列進(jìn)行OTU聚類，健康植株樣品共鑒定出真菌33個門、70個綱、121個目、196個科、232個屬、386個種和1 901個OTU;感染枯萎病植株樣品共鑒定出真菌34個門、68個綱、107個目、175個科、212個屬、350個種和1 817個OTU（表1）。

Venn圖分析結(jié)果（圖2）表明，健康和感染枯萎病植株根際真菌共享的OTUs為1 120個，而健康植株根際真菌特有的OTUs為781個，占其總數(shù)41.08%，感染枯萎病植株根際真菌特有的OTUs為697個，占其總數(shù)的38.36%?？梢?，健康辣椒植株根際土壤真菌特有的OTUs略高于感染枯萎病植株，感染枯萎病植株與健康植株根際土壤真菌群落有一定的差異。

2.3? ? 真菌多樣性指數(shù)

ACE、Chao指數(shù)用于表示樣品真菌群落豐富度，Shannon、Simpson指數(shù)用于表示樣品真菌群落多樣性，Coverage用于表示樣品測序的覆蓋度。其中，Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低，其余指數(shù)值越大，說明相應(yīng)的群落豐富度和多樣性越高。α多樣性分析表明（表2），健康植株根際土壤真菌群落多樣性高于感染枯萎病植株。

2.4? ? 真菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)

在門分類水平上（圖3），健康植株根際土壤真菌優(yōu)勢門是子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mucoromycota）和脊椎動物門（Vertebrata），其中，子囊菌門的豐度最高，為18.58%;感染枯萎病植株根際土壤真菌優(yōu)勢門是子囊菌門、綠藻門（Chlorophyta）和被孢霉門，其中子囊菌門的豐度最高，為38.23%，說明子囊菌門是主要優(yōu)勢菌門;其他真菌門相對豐度較低，健康的被孢霉門和脊椎動物門豐度分別是7.87%和5.15%，感染枯萎病的綠藻門和被孢霉門豐度分別是8.36%和5.55%。

在屬分類水平上（圖4），健康植株根際土壤真菌的群落優(yōu)勢屬是被孢霉菌屬（Mortierella）、假裸囊菌屬（Pseudogym-noascus）和鐮刀菌屬（Fusarium），而感染枯萎病植株根際土壤真菌的群落優(yōu)勢屬是紅曲霉菌屬（Monascus）、假裸囊菌屬和鐮刀菌屬;健康植株的被孢霉菌屬相對豐度是6.79%，比感染枯萎病植株增加了2.40個百分點(diǎn)，健康植株的假裸囊菌屬相對豐度是6.53%，比感染枯萎病植株下降了3.33個百分點(diǎn)，健康植株的鐮刀菌屬相對豐度是5.07%，比感染枯萎病植株下降了3.67個百分點(diǎn)，健康植株的紅曲霉菌屬相對豐度是1.1%，相較于感染枯萎病的植株下降了11.42個百分點(diǎn)。

3? ? 結(jié)論與討論

本研究通過Illumina Miseq測序技術(shù)分析健康辣椒和和感染枯萎病辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，測序數(shù)據(jù)合理。α多樣性分析表明，健康植株根際土壤的Shannon、ACE和Chao指數(shù)均高于感病植株，而Simpson指數(shù)低于患病植株，說明健康植株根際土壤真菌群落多樣性高于感病植株根際土壤真菌群落多樣性。研究表明，生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性越高，系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成越復(fù)雜，穩(wěn)定性也相對較高，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和多樣性與植物正常生長發(fā)育及病害防治有著緊密的聯(lián)系[17]。OTU聚類分析表明，健康植株根際真菌特有的OTU占其總數(shù)的41.08%，而枯萎病感病植株根際真菌特有的OTU占其總數(shù)的38.36%，健康辣椒植株根際土壤真菌特有的OTU略高于感染枯萎病植株，說明真菌群落多樣性的改變可能是辣椒感染枯萎病的特征之一。

真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，健康植株根際土壤真菌最優(yōu)勢門是子囊菌門，其次是被孢霉門和脊椎動物門;感病的最優(yōu)勢門同樣是子囊菌門，其次是綠藻門和被孢霉門。自然界中子囊菌門是已知真菌中最大的門，已知種類超過64 000種。研究表明，有許多種類的子囊菌是重要的植物病原菌，可以引起植物嚴(yán)重病害，子囊菌的營養(yǎng)方式有腐生、寄生和共生，寄生植物可引起植物病害[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)健康植株根際土壤真菌群體中子囊菌門的豐度比枯萎病感病植株的豐度低19.65個百分點(diǎn)。本研究中，健康植株根際土壤中被孢霉門的豐度比感病的高2.32個百分點(diǎn)，脊椎動物門健康植株度比感病植株的豐度高1.07個百分點(diǎn)，而綠藻門豐度比感病的低4.41個百分點(diǎn)。被孢霉菌是一類重要的低脂類和高脂類真菌，同時也是產(chǎn)生物柴油的理想菌種[21]。在屬水平上，健康植株根際土壤真菌群落最優(yōu)勢屬是被孢霉菌屬，相對豐度是6.79%，比枯萎病感病植株增加了2.40個百分點(diǎn)，患病植株根際土壤真菌的群落最優(yōu)勢屬是紅曲霉菌屬，相對豐度是12.52%，約是健康植株的11.4倍。研究發(fā)現(xiàn)，一些被孢霉菌屬能夠產(chǎn)生和利用多種脂肪酸，在膳食補(bǔ)充劑生產(chǎn)和生物燃料生產(chǎn)中具有重要的工業(yè)價(jià)值[22]。紅曲霉菌嗜酸，大多出現(xiàn)在乳酸自然發(fā)酵的基質(zhì)中，其具有抑菌、抗癌和提高免疫力的能力[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，假裸囊菌是嗜低溫真菌，具備特殊的生理代謝特征和防御機(jī)制，能夠適應(yīng)極端的環(huán)境[25]。鐮刀菌屬是植物枯萎病發(fā)生的重要病原菌，影響植株的正常生長。薛? 超[26]研究表明，鐮孢菌屬是香蕉枯萎病植株根際土壤中的主要類群，在枯萎病植株土壤樣品中的相對豐度比健康植株高1.5個百分點(diǎn)。本文患病植株的假裸囊菌屬和鐮刀菌屬相對豐度分別是9.86%和8.74%，分別比健康植株增加了3.33個百分點(diǎn)和3.67個百分點(diǎn)，與前人研究一致。

利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對健康和感染枯萎病辣椒植株根際土壤樣品的測序分析結(jié)果表明，感病植株根際土壤真菌群落多樣性降低且群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中鐮刀菌屬（Fusarium）數(shù)量增加是辣椒枯萎病患病的主要特征。

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