婁玲，陳長(zhǎng)寶，趙天倚，穆雙雙，王歡,※，王淑敏※

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)菌物藥生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

真菌多糖是自然界中存在種類較多、生物活性較高的一類活性多糖，是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的，由10 個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的高分子多聚物[1]?，F(xiàn)代研究表明，許多藥用真菌因具有抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力和抗感染等多種生理活性，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外科研工作者的關(guān)注[2]。

葉生小皮傘（Marasmius epiphyllus（Pers.）Fr.，隸屬于蘑菇綱（Agaricomycetes）蘑菇目（Agaricales）小皮傘科（Marasmiaceae）小皮傘屬（Marasmius），子實(shí)體小，菌蓋堅(jiān)韌，單生或散生，廣泛分布于華北、華中、東北等地[3]。液體發(fā)酵和固體發(fā)酵培養(yǎng)[4]，有利于葉生小皮傘工業(yè)大規(guī)模培養(yǎng)。本研究利用液體和固體發(fā)酵2種發(fā)酵方式對(duì)葉生小皮傘進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)定不同發(fā)酵產(chǎn)物中多糖的含量，不僅可作為衡量葉生小皮傘質(zhì)量指標(biāo)之一，而且為其發(fā)酵產(chǎn)物的藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 葉生小皮傘采于吉林省長(zhǎng)春市凈月潭國(guó)家森林公園，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為葉生小皮傘，分離純化得到其菌株ME-1。

1.1.2 儀器 TYS-200 高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）；HH6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AUY220 萬(wàn)分之一分析天平（島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；AU2450 紫外分光光度計(jì)（島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；TGL16 高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.3 試劑 D（+）無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；麥芽糖、酵母粉、磷酸二氫鉀和硫酸鎂（北京化工廠）。

1.2 方法

1.2.1 ME-1 液體深層發(fā)酵培養(yǎng) 3%麥芽糖，2%酵母粉，0.15% KH2PO4，0.1% MgSO4·7H2O；發(fā)酵條件為：在溫度為（27±1）℃，轉(zhuǎn)速為 150 r/min，適宜的pH 值為5～6，最佳裝量為 140 mL/500 mL，發(fā)酵天數(shù)為 10 d[5]。

1.2.2 ME-1 固體發(fā)酵培養(yǎng) 薏米∶麥麩=2∶1，含水量為80%、接種塊數(shù)為6 塊，pH值自然，發(fā)酵溫度（27±1）℃，發(fā)酵天數(shù)為20 d，60 ℃烘干備用。

1.2.3 ME-1 菌絲、發(fā)酵液以及固體發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)照品的制備 參照徐德峰等[6]對(duì)照品的制備方法，稱取無(wú)水葡萄糖適量，于105 ℃干燥至恒重后，精密稱取無(wú)水葡萄糖適量，加適量水溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成濃度為1.018 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

1.2.3.2 樣品的制備 稱取發(fā)酵液5.04g、菌絲3.50 g、固體發(fā)酵產(chǎn)物5.00 g，分別加水80.0 mL，于沸水浴中加熱 1 h 后，放冷，分別加水定容至 100.0 mL（v1），混勻后過(guò)濾，棄去初濾液，收集余下濾液，備用。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸收葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液 0.6、0.8、1.2、1.6、1.8、2.0 mL 置于 25.0 mL 比色管中，補(bǔ)水加至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，加 5.0 mL 的 H2SO4，混勻，沸水浴加熱 15.0 min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在492 nm波長(zhǎng)處以試劑空白為參比，1 cm 比色皿測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)（X）、吸光度（A）為縱坐標(biāo)（Y）繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]，得出回歸方程為Y=0.4514X 0.0728（r=0.9993），在0.610 8～2.036 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3.4 樣品多糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取上述濾液10.0mL（v2），置于50.0mL離心管中，加入無(wú)水乙醇20.0mL，混勻，于4 ℃冰箱靜止4 h 以上，以4 000 r/min 離心5.0 min，殘?jiān)?5%乙醇重復(fù)洗滌3 次。發(fā)酵液用水溶解定容至10.0 mL（v3）容量瓶中，菌絲用水溶解定容至5 mL（v3）容量瓶中，固體發(fā)酵產(chǎn)物定容至10.0 mL（v3）容量瓶中。分別精密吸取上述發(fā)酵液0.6 mL（v4）、菌絲 0.8 mL（v4）、固體發(fā)酵產(chǎn)物 0.7 mL（v4），按“1.2.3.3”的方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算樣品中粗多糖的含量，計(jì)算方法如下：

式中，X 為樣品中粗多糖含量（mg/g）；m1 為樣品測(cè)定液中葡萄糖的質(zhì)量（mg）；m2為樣品質(zhì)量（g）；v1為樣品提取液總體積（mL）；v2為沉淀粗多糖所用樣品提取液體積（mL）；v3為粗多糖溶液體積（mL）；v4為測(cè)定用樣品體積（mL）；0.9 為葡萄糖換算為粗多糖的系數(shù)。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度試驗(yàn) 吸取發(fā)酵液、菌絲及固體發(fā)酵物的樣品供試液，按照“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法計(jì)算多糖含量，重復(fù)測(cè)定6 次。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取發(fā)酵液、菌絲及固體發(fā)酵物的樣品供試液，按照“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法每隔5 min測(cè)定其吸光度。

1.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 吸取發(fā)酵液、菌絲及固體發(fā)酵物的樣品供試液，按照“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法計(jì)算供試液中多糖含量，重復(fù)測(cè)定6 次。

1.2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知多糖含量的供試品各6 份，精密加入葡萄糖對(duì)照品適量，按照“1.2.3.2”項(xiàng)下的制備方法得續(xù)濾液，按照“1.2.3.3”項(xiàng)下繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試液含量，計(jì)算加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗(yàn)

按照“1.2.4.1”項(xiàng)下的方法，精密度試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的吸光度平均值為0.589 3，RSD=1.62%；菌絲的吸光度平均值為 0.491 1，RSD=1.89%；固體發(fā)酵物的吸光度平均值為0.554 4，RSD=1.54%。RSD均小于2，表明該測(cè)量方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision test results

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照“1.2.4.2”方法操作，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的吸光度平均值為0.574 2，RSD=0.62%；菌絲的吸光度平均值為 0.478 3，RSD=0.65%；固體發(fā)酵物的吸光度平均值為0.513 5，RSD=1.91%。RSD 均小于2，表明該測(cè)量方法穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Stability test results

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“1.2.4.3”項(xiàng)下的方法，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的吸光度平均值為0.586 7，RSD=0.39%；菌絲的吸光度平均值為=0.478 3；RSD=1.05%；固體發(fā)酵物的吸光度平均值為0.557 2，RSD=1.28%。RSD 均小于2，表明該測(cè)量方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Reproducibility test results

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

按照“1.2.4.3”項(xiàng)下的方法，結(jié)果見(jiàn)表4～6，計(jì)算得出發(fā)酵液的平均回收率為98.55%，RSD=0.89%；菌絲的平均回收率為99.08%，RSD=1.68%；固體發(fā)酵物的平均回收率為 99.63%，RSD=1.38%?；厥章示?5%～105%，RSD均小于2，表明該測(cè)量方法準(zhǔn)確性良好。

表4 發(fā)酵液加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery rate tests of fermentation broth

表5 菌絲加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery rate tests of mycelium

表6 固體發(fā)酵物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of recovery rate tests of solid fermentation products

2.5 多糖含量的測(cè)定

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按照公式（1）計(jì)算得出，葉生小皮傘發(fā)酵液中多糖平均含量為42.56 mg/g，固體發(fā)酵產(chǎn)物中多糖的平均含量為 33.43 mg/g，菌絲中多糖的平均含量為19.61 mg/g（表7）。發(fā)酵液多糖約為菌絲體多糖含量的2.2 倍，是固體發(fā)酵物中多糖含量的1.3 倍。

3 討論

我國(guó)的真菌資源極其豐富，而目前大多數(shù)未被開發(fā)和利用，造成資源的浪費(fèi)。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，真菌多糖是食藥用菌中的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化等多種藥理作用[8]，雖然近年來(lái)我國(guó)食藥用菌多糖研究飛速發(fā)展，但真菌多糖制品與中藥現(xiàn)代化還存在一定差距[9-10]，因此，有必要對(duì)野生真菌資源進(jìn)行深入挖掘，尤其是真菌多糖的構(gòu)效關(guān)系，需要深入探究。

本研究對(duì)比了液體發(fā)酵和固體發(fā)酵2 種培養(yǎng)方式下，葉生小皮傘菌株ME-1 的發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量，同時(shí)對(duì)方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明，葉生小皮傘發(fā)酵液中多糖平均含量為42.56 mg/g，菌絲中多糖的平均含量為19.61 mg/g，固體發(fā)酵產(chǎn)物中多糖的平均含量為33.43 mg/g，發(fā)酵液多糖約為菌絲體多糖含量的2.2倍，是固體發(fā)酵物中多糖含量的1.3 倍。本研究為進(jìn)一步研究其多糖的結(jié)構(gòu)、活性以及發(fā)開多糖相關(guān)的功能性食品、藥品奠定基礎(chǔ)。