柏玲，朱言柱，胡博，朱翔宇，張海玲，廉士珍，張蕾※

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112）

水貂阿留申?。ˋleutian disease，AD）又稱為漿細(xì)胞增多癥，是由水貂阿留申病毒（Aleutian disease virus，ADV）引起的一種免疫抑制性疾病[1-2]。AD臨床上以免疫復(fù)合物沉積導(dǎo)致的腎小球腎炎、高丙種球蛋白增多和漿細(xì)胞增多為主要特征[3-4]；AD 廣泛存在于世界各養(yǎng)貂國(guó)家和地區(qū)，在我國(guó)主要養(yǎng)貂地區(qū)感染率達(dá)70%以上，患病水貂消瘦，毛皮質(zhì)量差，生育能力下降，嚴(yán)重危害水貂養(yǎng)殖業(yè)[5-6]。

ADV為無(wú)囊膜、二十面體、單股、線狀DNA病毒，ADV屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、阿留申病毒屬[7]。ADV 全長(zhǎng)4.8 kb，ADV 基因組主要有2 個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）：L-ORF 和 R-ORF。LORF 編碼 3 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3），R-ORF編碼 2 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1 和 VP2）[8-10]。與 VP2 蛋白相比，VP1 在N 端多42 個(gè)氨基酸，VP2 占病毒衣殼的90%[11-12]。目前尚無(wú)疫苗防控AD，其主要原因是動(dòng)物感染AD后，雖然會(huì)產(chǎn)生高水平抗體，但該抗體并無(wú)中和病毒的能力，反而會(huì)介導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)作用（antibody dependent enhancement，ADE），進(jìn)一步誘導(dǎo)病毒侵染機(jī)體，并且產(chǎn)生的抗原抗體復(fù)合物沉積，從而導(dǎo)致腎小球腎炎及動(dòng)脈炎。研究者嘗試制備ADV 滅活疫苗，雖然可以產(chǎn)生抗體，但會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)病毒侵染。Aasted等[13]通過(guò)表達(dá)ADV 病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2 及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，將純化的蛋白對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP2免疫并無(wú)保護(hù)作用，反而導(dǎo)致動(dòng)物死亡；NS1 免疫只有部分保護(hù)作用。近年來(lái)，核酸疫苗成為熱點(diǎn)，核酸疫苗又稱為基因疫苗，是將外源基因插入至真核表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒，將質(zhì)粒通過(guò)肌注等方式導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，使動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。核酸疫苗在機(jī)體內(nèi)表達(dá)的蛋白更接近于天然狀態(tài)，其免疫原性更好。與常規(guī)疫苗相比，它解決了主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性問(wèn)題，不僅能產(chǎn)生體液免疫，還能產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫，這對(duì)抵抗病毒及胞內(nèi)寄生菌的侵染尤為重要。同時(shí)，核酸疫苗具有制備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低、易于構(gòu)建成復(fù)合疫苗（多價(jià)苗或嵌合疫苗或聯(lián)合苗）和便于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)。2005 年，Castelruiz 等[14]將ADV的NS1 基因連接至真核表達(dá)載體Pvr1012，構(gòu)建核酸疫苗免疫水貂，發(fā)現(xiàn)可以起到部分保護(hù)作用，這為阿留申病的疫苗研究提供了思路。

Bloom 等[12-15]將VP2 分成9 個(gè)非折疊的片段進(jìn)行原核表達(dá)，證實(shí)VP2 上存在明確的與宿主致病性和宿主選擇性密切相關(guān)的抗原決定簇，在探究衣殼蛋白柔性區(qū)的短肽序列是否是ADV 致病相關(guān)抗體的靶點(diǎn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn) VP2 蛋白 428～446 aa 及 487～501 aa 為抗原抗體復(fù)合物主要的結(jié)合位置，介導(dǎo)ADE，將VP2中上述的2 個(gè)肽段去除將有望降低ADE。IL-12 及IFN-具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫的功能，被證明可作為佐劑增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答[16-17]。本研究通過(guò)比對(duì)國(guó)內(nèi)外強(qiáng)毒株氨基酸序列，保留強(qiáng)毒株關(guān)鍵性位點(diǎn)，去除上述2 段導(dǎo)致ADE 的肽段后，進(jìn)行核酸疫苗的構(gòu)建，同時(shí)構(gòu)建與細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-12 及IFN-的真核表達(dá)質(zhì)粒作為免疫佐劑，在體外，通過(guò)Western Blot及間接免疫熒光驗(yàn)證上述真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)，旨在為后期用于免疫，研制出對(duì)水貂阿留申病有效的疫苗及未來(lái)應(yīng)用于水貂阿留申病的防控提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒

293T細(xì)胞株及pVAX1 質(zhì)粒為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病防控研究室保存。

1.2 主要試劑及儀器

T4 DNA連接酶（上海賽默飛世爾科技有限公司）；Fugene HD 轉(zhuǎn)染試劑（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司）；FITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG、Anti-6 His tags 抗體（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP 標(biāo)記的山羊抗貓IgG、FITC 標(biāo)記的羊抗貓IgG（美國(guó)KPL 生物公司）；PrimeSTAR Max Polymerase、DH5感受態(tài)細(xì)胞（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；ECL 顯色液、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)及核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（北京全式金生物有限公司）；RIPA、蛋白酶抑制劑及小鼠IFN-ELISA 檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；小鼠IL-12 ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；蛋白電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)生物公司）；PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；ADV陽(yáng)性血清由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.3 VP2主要抗原表位區(qū)及IL-12、IFN-序列確定和引物設(shè)計(jì)

以ADV-G 株VP2 基因序列為骨架，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有34 株國(guó)內(nèi)ADV 強(qiáng)毒株的VP2 基因序列的比對(duì)，保留強(qiáng)毒株共有的關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)，替換ADVG 株VP2 的相應(yīng)表位位置，同時(shí)去除抗原抗體復(fù)合物形成的關(guān)鍵區(qū)域，將整合好的序列按照真核基因偏好性密碼子進(jìn)行優(yōu)化后，交由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行基因合成。IL-12 的亞基（p35）序列參照Gen-Bank：NP_001152896.1，亞基（p40）序列參照Gen-Bank：NM_001303244.1亞基與 亞基之間的柔性肽為（G4S）4。IFN-序列參照 GenBank：XM_021205593.1，同時(shí)在氨基酸序列的C 端添加6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽，交由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行基因合成，各基因分別連至克隆載體pMD18T 的多克隆位點(diǎn)中，命名為pMD18-M、pMD18-IL、pMD18-IFN-，為了與真核表達(dá)載體pVAX1 相連及后續(xù)表達(dá)，通過(guò)PCR 在引物的5'端增加kozak序列和酶切位點(diǎn)EcoR I，在3'端增加酶切位點(diǎn)XhoI及終止密碼子，同時(shí)構(gòu)建帶有EGFP標(biāo)簽的pVAX1-EGFP的陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照，VP2 主要抗原表位區(qū)（命名為M）的引物為M1、M2，IL-12 的引物為IL1、IL2，及 IFN-的引物為 IF1、IF2，EGFP 的引物為 EP1、EP2（表1），引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 VP2基因疫苗及IL-12、IFN-細(xì)胞因子佐劑真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

用質(zhì)粒提取試劑盒提取各克隆質(zhì)粒，以此為模板，用設(shè)計(jì)的引物及高保真酶進(jìn)行PCR，PCR 反應(yīng)體系50L：PrimeSTAR Max Polymerase 25L，上下游引物各1.5L，模板 50 ng，ddH2O 補(bǔ)齊至 50L；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收后將產(chǎn)物連接于pVAX1 載體上，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序后，確認(rèn)克隆成功，將陽(yáng)性質(zhì)粒及pVAX1 空載體用EcoR I 及Xho I 進(jìn)行雙酶切，連接后，轉(zhuǎn)化入DH5感受態(tài)細(xì)胞，接種于含卡那抗性的LB 瓊脂平板，挑取陽(yáng)性克隆接種于含卡那抗性LB 液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序，將連接正確的VP2 陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pVAX1-M，IL-12 陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pVAX1-IL，IFN陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pVAX1-IF，同時(shí)，連有EGFP 標(biāo)簽的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒命名為pVAX1-EGFP。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒pVAX1-M、pVAX1-IL、pVAX1-IF、pVAX1-EGFP 及pVAX1 空載體，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，保存于-20 ℃?zhèn)溆?；取出培養(yǎng)至單層的293T 細(xì)胞，倒出原培養(yǎng)基，用PBS 清洗，加入適量0.25%的胰酶進(jìn)行消化，鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞有分散跡象時(shí)，加入DMEM培養(yǎng)基中和，輕柔吹打細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。向6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1 106個(gè)細(xì)胞，并用DMEM 培養(yǎng)基補(bǔ)齊至2 mL，置于37 ℃、CO2 培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，按照Fugene HD 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染30 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.6 真核表達(dá)產(chǎn)物鑒定

1.6.1 間接免疫熒光 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染30 h 后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。吸去6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的DMEM 培養(yǎng)基，沿側(cè)壁緩緩加入PBS清洗，將PBS吸凈，加入預(yù)冷的4%的多聚甲醛1 mL，置于4 ℃冰箱固定30 min后，棄掉多聚甲醛，PBST 漂洗 3 次，每次 5 min；加入0.5%的TritonX-100 進(jìn)行細(xì)胞打孔，于室溫靜置10 min，棄掉后，PBST 漂洗3 次，每次5 min；加入5%脫脂乳1 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱封閉1 h；棄掉封閉液，PBST漂洗3 次，每次5 min；以ADV 陽(yáng)性血清（稀釋倍數(shù)1∶10）及His標(biāo)簽鼠單克隆抗體（稀釋倍數(shù)1∶1 000）分別作為一抗，37 ℃孵育 1 h，PBST 漂洗 3 次，每次5 min，以FITC 標(biāo)記的羊抗貓多克隆抗體（稀釋倍數(shù)1∶5 000）及FITC 標(biāo)記的兔抗鼠多克隆抗體（稀釋倍數(shù)1∶5 000）分別作為二抗，37 ℃孵育 1 h，PBST漂洗3 次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

1.6.2 Western Blot 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染30 h后進(jìn)行Western Blot。吸去6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的DMEM 培養(yǎng)基，沿側(cè)壁緩緩加入PBS清洗，將PBS吸凈，每孔加入200L 的RIPA（含有終濃度為 1 mmol/L 的蛋白酶抑制劑PMSF），冰上放置10 min，待細(xì)胞脫落后，回收至1.5 mL離心管，4 ℃、12 000 r/min，離心 10 min，小心吸取上清，按比例加入6 protein loading buffer，煮沸5 min，每孔20L 樣品，SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印至 NC 膜，用含5%脫脂乳的TBST 緩沖液封閉，4℃過(guò)夜。pVAX1-IL、pVAX1-IF 的C 端帶有6 His 標(biāo)簽，分別以小鼠抗His標(biāo)簽抗體（稀釋倍數(shù)1∶1 000）和ADV 陽(yáng)性血清（稀釋倍數(shù)1∶200）為一抗，山羊抗小鼠HRP-IgG（稀釋倍數(shù)1∶10 000）和山羊抗貓HRP-IgG（稀釋倍數(shù)1∶4 000）為二抗，進(jìn)行Western Blot 分析目的蛋白的表達(dá)及反應(yīng)原性。

1.6.3 ELISA （1）IL-12 的檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染 48 h 后，利用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，4 ℃、2 000 r/min，離心20 min，取上清10L 按照1∶10 進(jìn)行稀釋，即15L 的細(xì)胞上清+135L 的樣品稀釋液，每孔50L 進(jìn)行 ELISA檢測(cè)。取出試劑盒中的酶標(biāo)板恢復(fù)至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度（80、40、20、10、5、2.5pg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)品 50L，除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100L，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育60 min。棄去液體，吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液350L，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙拍干，如此重復(fù)5 次。每孔加入底物A、B各50L，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50L，15 min 內(nèi)，在 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 值。利用ELISA Calc回歸計(jì)算程序-v0.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中IL-12 的濃度。（2）IFN-的檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，利用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，4 ℃、2 000 r/min，離心20 min，取上清25L 按照1∶2 進(jìn)行稀釋，即120L 的細(xì)胞上清+120L的樣品稀釋液。IFN-標(biāo)準(zhǔn)品稀釋按照博士德小鼠IFN-檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別為2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2 pg/mL。將各梯度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品各100L 依次加入孔中，每個(gè)做1 個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃孵育90 min；甩去液體，吸水紙拍幾下，不洗；將準(zhǔn)備好的生物素抗小鼠IFN-抗體工作液每孔100L依次加入（TMB顯色孔除外）。酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃孵育60 min；洗板3 次，每次浸泡1 min；將準(zhǔn)備好的ABC 工作液按每孔100L依次加入（TMB 空白顯色孔除外），酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃孵育 30 min；洗板5 次，每次浸泡1 min；每孔加入TMB 顯色液90L，37 ℃避光孵育 20 min；按每孔100L 加入TMB 終止液，此時(shí)藍(lán)色立即變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值。利用軟件CurveExpert 1.4，輸入數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，計(jì)算樣品中IFN-的濃度。

1.6.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ELISA檢測(cè)獲得的結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件和單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

通過(guò)PCR 和雙酶切方法，將VP2 抗原表位M、小鼠細(xì)胞因子IL-12 片段、小鼠細(xì)胞因子IFN-片段及熒光標(biāo)簽EGFP 基因分別連接于真核表達(dá)載體pVAX1，獲得目的質(zhì)粒 pVAX1-M、pVAX1-IL、pVAX1-IF 及pVAX1-EGFP，經(jīng) EcoR I 及 Xho I 雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳均顯示有2 條特異條帶，大小與預(yù)期一致（圖1～4），目的基因的條帶大小分別為 1 866、1 748、518、720 bp；進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，序列正確，各真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pVAX1-M 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 pVAX1-M double digestion identification result

圖2 pVAX1-IL 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 pVAX1-IL double digestion identification result

圖3 pVAX1-IF 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 pVAX1-IF double digestion identification result

圖4 pVAX1-EGFP 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.4 pVAX1-EGFP double digestion identification result

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

為觀察轉(zhuǎn)染效果，將pVAX1-EGFP同步轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，30 h 后觀察轉(zhuǎn)染效果（圖5），結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染成功，鏡下可見(jiàn)明顯的熒光，證明轉(zhuǎn)染體系合理，且真核表達(dá)載體pVAX1 可正常表達(dá)蛋白。

圖5 pVAX1-EGFP 轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.5 Transfection result of pVAX1-EGFP

2.3 間接免疫熒光鑒定

2.3.1 重組蛋白反應(yīng)原性的鑒定 將 pVAX1-M 及pVAX1 轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，培養(yǎng)30 h 后，利用間接免疫熒光，對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，一抗為ADV 陽(yáng)性血清，結(jié)果顯示，pVAX1-M質(zhì)?？卓梢?jiàn)特異性熒光，空載體pVAX1 無(wú)（圖6），證明pVAX1-M 質(zhì)粒在體外可正常表達(dá)蛋白，且該蛋白具有反應(yīng)原性。

圖6 pVAX1-M質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒pVAX1 體外轉(zhuǎn)染間接免疫熒光結(jié)果Fig.6 Indirect immunofluorescence results of transfection of pVAX1-M plasmid and empty vector plasmid pVAX1

2.3.2 細(xì)胞因子表達(dá)情況 將各細(xì)胞因子真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，培養(yǎng)30 h 后，利用間接免疫熒光，對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，一抗為His 標(biāo)簽鼠單抗，結(jié)果顯示，pVAX1-IL 質(zhì)?？卓梢?jiàn)特異性熒光（圖7），pVAX1-IF質(zhì)?？卓梢?jiàn)特異性熒光（圖8），而對(duì)照空載體pVAX1 質(zhì)?？谉o(wú)特異性熒光（圖9），證明各細(xì)胞因子真核表達(dá)質(zhì)?？稍隗w外正常表達(dá)蛋白。

2.4 Western Blot鑒定

將含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)30 h后，將細(xì)胞刮下，提取蛋白，加入蛋白protein loading buffer 進(jìn)行制樣，利用Western Blot 對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)一步驗(yàn)證，一抗分別為ADV 陽(yáng)性血清及His 單抗，結(jié)果顯示，各真核表達(dá)質(zhì)粒可正常表達(dá)蛋白，pVAX1-M 表達(dá)的蛋白大小約為70.5 kDa（圖10），且具有反應(yīng)原性，pVAX1-IL 表達(dá)蛋白大小約為 60.0 kDa（圖11），pVAX1-IF 表達(dá)的蛋白大小約為19.0 kDa（圖12）。

2.5 ELISA鑒定

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，將細(xì)胞刮下，離心后取上清進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，利用各細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值及對(duì)應(yīng)濃度得到的回歸方程繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，IL-12的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=0.106+0.027x（r2=0.997）；IFN-的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=（11.823+179.623x）/（1 33.912x 318.513x2）（r2=0.999）。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖13、14。

圖13 IL-12 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.13 IL-12 standard curve

圖14 IFN-標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.14 IFN-standard curve

根據(jù)檢測(cè)樣品的OD 值換算其濃度，結(jié)果顯示，pVAX1-IL 及 pVAX1-IF 中 IL-12 或 IFN的水平明顯高于pVAX1 空載對(duì)照組，差異極顯著（P ＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表2 和圖15，證明構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-IL及pVAX1-IF在體外可有效表達(dá)目的蛋白，且具有活性，后期可作為免疫佐劑使用。

表2 IL-12 及IFN- 表達(dá)情況Table 2 IL-12 and IFN- expression （pg/mL）

圖15 IFN與IL-12 濃度柱形圖Fig.15 Histogram of IFN-and IL-12 concentration

3 討論

AD 是典型的免疫復(fù)合物疾病，動(dòng)物在感染AD后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生高水平的抗體，卻不能中和病毒，反而會(huì)與抗原形成復(fù)合物，沉積于腎臟上皮或動(dòng)脈并發(fā)炎癥，抗體進(jìn)一步介導(dǎo)ADV 的侵染，產(chǎn)生抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE）。作為水貂養(yǎng)殖業(yè)的三大疫病之一，研發(fā)出有效的疫苗進(jìn)行防控為首選手段，前人也曾嘗試研制常規(guī)的疫苗，如滅活疫苗、減毒疫苗及亞單位疫苗等，但由于該病特殊的致病特點(diǎn)，均未有良好的保護(hù)效果，甚至因抗體依賴性增強(qiáng)導(dǎo)致病毒的進(jìn)一步侵染，ADV 的防控亟需研制一種安全有效的疫苗。

近年，新型疫苗的涌現(xiàn)給疾病防控帶來(lái)疫苗研發(fā)新角度，其中作為引發(fā)第三次疫苗革命的核酸疫苗被研究者青睞。由于核酸疫苗在進(jìn)入體內(nèi)后，是由機(jī)體細(xì)胞來(lái)表達(dá)外源蛋白，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，這種內(nèi)源性的抗原可突破傳統(tǒng)疫苗只能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫的限制，可產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。而AD由于其ADE作用，傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)生的抗體并非保護(hù)性抗體，反而加重疾病，立足于體液免疫的傳統(tǒng)疫苗顯然不適合阿留申病疫苗的研發(fā)，細(xì)胞免疫對(duì)其免疫效果尤為重要。為增強(qiáng)疫苗的免疫效果，佐劑常被應(yīng)用于疫苗免疫中，而佐劑的選擇取決于疫苗的類型和免疫目的，有研究者為增強(qiáng)疫苗細(xì)胞免疫的效果，利用與細(xì)胞免疫相關(guān)的細(xì)胞因子IL-12 及IFN的聯(lián)合免疫增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答[18-19]。IL-12 由異源二聚體p30 和p45 通過(guò)共價(jià)鍵連接而成，小鼠IL-12 的分子量大小約為60 kDa，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th0 細(xì)胞增殖分化成Th1 細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生IFN-，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫，2 個(gè)亞基共同表達(dá)才可發(fā)揮其生物學(xué)功能[20-22]。IFN-即II型干擾素，小鼠IFN-分子量大小約為19 kDa，是一種具有抗病毒、抗腫瘤并且具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，可促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)組織相容性復(fù)合物，從而增強(qiáng)抗原遞呈能力，同時(shí)可誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞分化為Th1 細(xì)胞，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫水平[23-24]。登革熱病是一種導(dǎo)致人死亡率及發(fā)病率很高的烈性傳染病，在其疫苗的研發(fā)中同樣受ADE 效應(yīng)困擾，國(guó)外有學(xué)者通過(guò)構(gòu)建登革熱病毒（DENV）E 蛋白的DIII 結(jié)構(gòu)域的核酸疫苗，可引起該病毒 4 種血清型的免疫反應(yīng)[25]。2015 年，Tang等[26]在定位DENV2 型的E 蛋白I～I(xiàn)I 結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)致抗體依賴性增強(qiáng)的表位后，構(gòu)建去除導(dǎo)致ADE的表位基因片段的DNA 疫苗，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，該DNA 疫苗在體內(nèi)可產(chǎn)生良好的中和保護(hù)效應(yīng)。由此可見(jiàn)，構(gòu)建去除ADE 片段的核酸疫苗對(duì)ADE 相關(guān)疾病的疫苗研發(fā)具有參考價(jià)值，這也為 ADV 疫苗的研發(fā)提供了思路。VP2 作為ADV 衣殼蛋白的主要構(gòu)成蛋白，成為疫苗研發(fā)的首選抗原，雖然表面有豐富的抗原決定簇，但由于ADE 作用，前人曾將VP2 免疫動(dòng)物，并不能起到期望的保護(hù)力。Bloom 等[15]研究發(fā)現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物結(jié)合和產(chǎn)生 ADE 作用的主要位置為 VP2 蛋白的428～446 aa 及 487～501 aa。在 ADV 核酸疫苗的構(gòu)建中，選擇含有豐富抗原決定簇的VP2 的基因片段為骨架，去除上述導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物結(jié)合和產(chǎn)生ADE作用的2 段肽段，將降低VP2 的ADE 作用，同時(shí)有望在免疫后產(chǎn)生中和保護(hù)效應(yīng)，這種新型的AD 核酸疫苗為解決目前AD 無(wú)疫苗防控帶來(lái)了希望。

本研究以DNA 疫苗專用載體pVAX1 為載體，構(gòu)建了不含抗原抗體復(fù)合物表位的 VP2 基因疫苗及IL-12 和IFN細(xì)胞因子佐劑，通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別進(jìn)行間接免疫熒光、Western Blot 和ELISA 驗(yàn)證目的基因在體外表達(dá)情況，結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為下一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。