高 敏，汪建明,*，甄靈慧，于景華，張偉偉

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.山東天博食品配料有限公司，山東 濟寧 272000）

我國畜牧資源十分發(fā)達，隨著畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的興盛，其副產(chǎn)物畜禽骨的產(chǎn)量也隨之增加，而提高畜禽骨資源的開發(fā)利用程度，對于畜禽骨的綜合開發(fā)具有極大的經(jīng)濟效益和社會效益，現(xiàn)今我國對畜禽骨的利用尤其是對牛骨的開發(fā)利用程度還存在一定的局限性，因此生產(chǎn)附加值更高且利用率更高的牛骨產(chǎn)品，已成為牛骨開發(fā)的重點和熱點[1-2]。

鈣對維持機體的健康起著無法替代的作用[3]。鈣提高了細胞內(nèi)的代謝水平、促進了骨骼生長，對神經(jīng)的調(diào)節(jié)、肌肉的收縮、心臟功能的穩(wěn)定以及有絲分裂等都發(fā)揮了十分重要的作用[4-5]。同時，鈣還參與傳導(dǎo)了一些重要的生理功能如激素應(yīng)激反應(yīng)、細胞增殖以及神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)釋放[6]。大量研究表明鈣攝入不充足會導(dǎo)致骨鈣的流失，易患骨質(zhì)疏松等疾病，所以研發(fā)經(jīng)濟、高效而又安全的補鈣劑是解決這一社會熱點問題的主要方法。然而，市場上現(xiàn)有的補鈣劑均存在一定程度的不足，主要在于其進入腸道后容易與膳食中的草酸、植酸以及磷酸等物質(zhì)形成沉淀，抑制鈣的吸收[7]。對比大眾比較認可的能使機體同時補充氨基酸與鈣的氨基酸鈣[8]，肽鈣螯合物由于其特有的螯合吸收轉(zhuǎn)運機制，能夠顯著提高機體對鈣的吸收[9-10]，同時，分子質(zhì)量更小的肽可提高礦物類元素的生物利用度[11-12]，因此研發(fā)能提高機體對鈣吸收利用率的肽鈣螯合物迫在眉睫。

本研究以螯合率、鈣質(zhì)量分數(shù)為評價指標，制備促鈣離子吸收肽，采用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)；運用多種光譜分析方法研究螯合前后二者的結(jié)構(gòu)差異，以期為后續(xù)鈣螯合多肽的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨粉（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)23.618%） 天津北洋百川生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶 天野酶制劑（江蘇）有限公司；氯化鈣、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、乙二胺四乙酸四鈉鹽、三乙醇胺（triethanolamine，TEOA）、鈣紅指示劑（均為分析純） 天津鼎國生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；H05-1型恒溫磁力攪拌器 天津東南儀誠科技有限公司；AB204-N型電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；BT-90型納米粒度儀 丹東市百特儀器有限公司；IS50型傅里葉紅外光譜儀 美國尼利高公司；UV-2250PC型紫外-可見光分光光度計、RF-5301PC型熒光分光光度計 日本島津公司；SU1510型掃描電子顯微鏡 日本日立公司；TURBISCAN LAB分散穩(wěn)定性分析儀 法國Formulaction公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽的制備

將牛骨蛋白采用雙酶水解法進行酶解，酶解條件：先經(jīng)中性蛋白酶酶解，料水比5%、加酶量2.5%、溫度50 ℃、pH 7.0、時間4 h，結(jié)束后沸水浴中滅酶15 min，等溫度降低后進行堿性蛋白酶酶解，調(diào)節(jié)料水比4%、加酶量2.0%、溫度50 ℃、pH 8.5、時間4 h，再次沸水浴滅酶15 min，經(jīng)冷凍干燥制得多肽粉。

1.3.2 肽鈣螯合物的制備及測定

1.3.2.1 螯合物的制備

稱取0.6 g多肽粉以及0.3 g氯化鈣于10 mL去離子水中充分溶解，調(diào)整pH 8.0后放入60 ℃恒溫水浴鍋螯合40 min后取出冷卻，加入質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇，并使乙醇體積分數(shù)達到約70%進行醇沉并于6 000 r/min離心10 min，洗滌數(shù)次后[13]，得到沉淀物，最后經(jīng)-50 ℃冷凍干燥36 h制得成品。

1.3.2.2 鈣質(zhì)量分數(shù)的測定

經(jīng)醇沉得到的反應(yīng)產(chǎn)物加適量酸于三角瓶中溶解定容至25 mL，加入大約1 mL掩蔽劑TEOA并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 12，用EDTA標準溶液滴定[14]，按式（1）計算鈣質(zhì)量分數(shù)：

式中：C為標定的EDTA濃度/（mol/L）；V為消耗的EDTA體積/mL；40為鈣的摩爾質(zhì)量（g/mol）；m為制得的復(fù)合物質(zhì)量/g。

1.3.2.3 肽鈣螯合率的測定

螯合率的測定：采用EDTA絡(luò)合滴定法[15]。

螯合物中總鈣含量的測定：移取螯合肽鈣溶液5 mL，加入25 mL蒸餾水和1 mL的TEOA，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 12，加入鈣羧酸指示劑3 滴，立即用EDTA標準溶液滴定，直至顏色由酒紅色變?yōu)榧兯{色。所用EDTA體積記為V1/mL。

螯合物中螯合態(tài)鈣含量的測定：移取螯合肽鈣溶液5 mL，加入8 倍體積的無水乙醇，離心取沉淀，用25 mL蒸餾水溶解沉淀并加入1 mL的TEOA，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 12，加入鈣羧酸指示劑3 滴，立即用EDTA標準溶液滴定，直至顏色由酒紅色變?yōu)榧兯{色，所用EDTA體積記為V2/mL。按式（2）計算螯合率：

1.3.3 單因素試驗

在肽鈣質(zhì)量比1∶2、溫度50 ℃、時間30 min條件下，考察pH值（5、6、7、8、9）對螯合率以及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響，選擇最合適的螯合pH值；根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在pH 8、肽鈣質(zhì)量比1∶2、溫度50 ℃時，考察螯合時間（20、30、40、50、60 min）對螯合率以及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響，選擇最合適的螯合時間；同理，固定pH 8、螯合時間40 min、肽鈣質(zhì)量比選擇1∶2時，考察螯合溫度（30、40、50、60、70 ℃）對螯合率以及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響，選擇最合適的螯合溫度；最后在固定pH 8、螯合時間40 min、螯合溫度60 ℃時，考察肽鈣質(zhì)量比（1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）對螯合率以及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響，選擇最合適的肽鈣質(zhì)量比。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以鈣質(zhì)量分數(shù)及螯合率為指標，設(shè)計3因素3水平正交試驗見表1。

表 1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 肽鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 紫外光譜分析

將多肽以及肽鈣螯合物配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液后，以Tris-HCl緩沖液作參比，用紫外分光光度計掃描測定波長208～248 nm之間紫外吸收的變化。

1.3.5.2 熒光光譜分析

在RF-5301熒光分光光度儀進行熒光光譜分析，測定溫度25 ℃，肽以及肽鈣螯合物質(zhì)量濃度為1 mg/mL，測定參數(shù)：激發(fā)波長280 nm，狹縫5 nm。測定溶液在不同波長條件下的熒光強度，記錄溶液熒光強度隨波長的變化。

1.3.5.3 紅外光譜分析

將凍干后的干燥多肽以及肽鈣螯合物取1 mg放入瑪瑙研缽中再放入干燥的KBr 150 mg，混合并壓制成1 mm厚的透明薄片，放入測定室內(nèi)，采用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1掃描得到紅外光譜圖，用OMNIC 8.2數(shù)據(jù)處理軟件進行處理。

1.3.5.4 粒徑與穩(wěn)定性分析

采用動態(tài)光散射技術(shù)測量樣品粒徑大小，用純凈水清洗樣品池直至背景清晰。將處理好的待測樣品緩慢加入樣液池中，至遮光率在10%～15%范圍內(nèi)，每個樣品掃描3 次，取平均值。

采用TURBISCAN LAB分散穩(wěn)定性分析儀測定樣品的穩(wěn)定性。將待測樣品加入到儀器配套的柱狀透明玻璃瓶中備測，約放入容器整體容積的4/5，此實驗反映被測樣品的背散射光在掃描時間內(nèi)隨著時間變化所產(chǎn)生的平均變化率，即穩(wěn)定性動力學(xué)參數(shù)，且穩(wěn)定性動力學(xué)參數(shù)與體系穩(wěn)定性呈負相關(guān)。本實驗采用的測試時間為8 h，時間間隔0.5 h，根據(jù)穩(wěn)定性動力學(xué)參數(shù)判斷其穩(wěn)定性。

1.3.5.5 掃描電子顯微鏡觀察

將適量的多肽粉末與肽鈣螯合物的凍干粉末樣品分別均勻涂抹于樣盤，噴金鍍膜處理，施加電壓聚焦清晰后，在放大倍數(shù)為500及5 000條件下獲取圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用SPSS進行處理分析，Excel進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 pH值對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響

圖1 pH值對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響Fig. 1 Effect of pH on chelation rate and calcium content

由圖1可知，當pH 5～8時，鈣質(zhì)量分數(shù)以及螯合率隨pH值升高而不斷增加，原因可能在于隨著pH值升高氫離子的濃度減小，與金屬離子爭搶供電集團的能力減弱，從而使得鈣離子與—NH2和—COOH的配位能力增強。而在pH 8時，鈣質(zhì)量分數(shù)以及螯合率都達到最大值，是由于此時有較多酸性及堿性的多肽物質(zhì)處于等電點附近，受H＋和OH-影響較小，提供了充分的供電基團，從而有利于螯合物的形成[16-17]。而在強堿性條件下，OH-與供電子基團爭奪金屬鈣離子形成了羥橋化物，從而產(chǎn)生氫氧化物的沉淀，不利于螯合物的形成，因此選擇pH 8較為合適。

2.1.2 時間對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響

圖 2 時間對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響Fig. 2 Effect of reaction time on chelation rate and calcium content

由圖2可知，隨著時間的延長，螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)均先增加后減小，在40 min達到最大值。原因在于時間過短將導(dǎo)致反應(yīng)不徹底，致使產(chǎn)物中含有大量的游離金屬離子和配體，造成原料浪費。而螯合時間過長不僅會降低生產(chǎn)效率，而且可能會使螯合物發(fā)生解離作用，同時可能會產(chǎn)生不利于螯合反應(yīng)進行的副反應(yīng)。因此選40 min為宜。

2.1.3 溫度對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響

圖 3 溫度對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on chelation rate and calcium content

由圖3可知，隨著溫度的升高，螯合率以及鈣質(zhì)量分數(shù)雖發(fā)生變化但波動幅度較小，說明溫度不是反應(yīng)的主要影響因素，對二者的影響不大，這與多位學(xué)者的研究結(jié)果相近[18-20]。但由于螯合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，適當高溫有利于提高多肽的溶解度，增加多肽與鈣離子的接觸面積，使螯合反應(yīng)進行順利。同時溫度過高出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于生成肽-M形式的產(chǎn)物時，生成了新鍵，釋放一定熱量，不利于正向反應(yīng)的進行。因此綜合考慮選擇60 ℃為宜。

2.1.4 肽鈣質(zhì)量比對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響

圖 4 肽鈣質(zhì)量比對螯合率及鈣質(zhì)量分數(shù)的影響Fig. 4 Effects of mass ratio between peptide and calcium on chelating rate and calcium content

從圖4可知，肽鈣質(zhì)量比對螯合反應(yīng)影響顯著。隨著質(zhì)量比的增大，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在2∶1達到最大值。加入過量的多肽時產(chǎn)品的得率反而下降，其顯然不符合經(jīng)濟效益；而加入過量鈣源，則有部分鈣未參與到反應(yīng)中。綜合考慮既要保證原料充分利用，又要降低產(chǎn)品成本，獲得最大經(jīng)濟效益，因此選擇肽鈣質(zhì)量比為2∶1較為合適。

2.2 正交試驗結(jié)果

采用極差分析法對表2正交試驗結(jié)果進行分析，可知各因素對鈣質(zhì)量分數(shù)的主次影響順序為肽鈣質(zhì)量比＞時間＞pH值，而對螯合率的影響順序為時間＞肽鈣質(zhì)量比＞pH值，兩者存在一應(yīng)差異，優(yōu)化后的最優(yōu)組合為A2B2C2，即時間40 min、肽鈣質(zhì)量比2∶1、pH 8.0。對此條件進行驗證，測得其鈣質(zhì)量分數(shù)為（21.29±1.21）%，螯合率為（38.97±0.80）%。

表 2 牛骨多肽與鈣離子螯合正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

2.3 肽鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外光譜分析

圖 5 多肽以及肽鈣螯合物的紫外掃描圖譜Fig. 5 Ultraviolet absorption spectra of peptide and peptide-calcium chelate

紫外光譜是一種可用于研究物質(zhì)變化以及測定是否有新的物質(zhì)出現(xiàn)的分析方法[21]。對多肽以及肽鈣螯合物進行紫外掃描，由圖5可以看出，多肽在208～233 nm波長之間有較強的吸收，這是肽鍵的特征吸收峰。比較兩物質(zhì)的紫外掃描圖譜，發(fā)現(xiàn)多肽的吸收峰值在212 nm，肽鈣螯合物的紫外吸收峰在210 nm，表明與鈣結(jié)合以后，多肽的吸收峰發(fā)生了整體移動，峰的位置向短波長移動。這是由于過渡金屬離子自身以及與其形成的配合體都會吸收紫外區(qū)的一部分波長而形成電子的躍遷，并且螯合物的中央離子與配位體鍵合造成了配位體內(nèi)部的電子的躍遷與游離的配位體內(nèi)部的電子躍遷所需的能量有所差別，同時相應(yīng)原子的價電子的躍遷也發(fā)生了變化，因此在螯合過程中對紫外光的吸收發(fā)生了改變。這與許先猛等[22]的研究結(jié)果相類似。由此證明了肽鈣螯合物是一種不同于多肽的新物質(zhì)。

2.3.2 熒光光譜分析

圖 6 多肽及肽鈣螯合物的熒光掃描圖譜Fig. 6 Fluorescence spectra of peptide and peptide-calcium chelate

根據(jù)現(xiàn)有研究可知，在蛋白質(zhì)中，只有Trp、Tyr及Phe 3 個氨基酸殘基由于側(cè)鏈生色基團的不同，能形成不同的熒光光譜從而能發(fā)射熒光[23]。由圖6可以看出，當激發(fā)波長調(diào)整為280 nm時，多肽的熒光峰λ1emma=x311 nm，表明是Tyr殘基的典型熒光峰位置。λ2emma=x355 nm，表明是Trp殘基的典型熒光峰位置。而經(jīng)過螯合反應(yīng)形成的肽鈣復(fù)合物由于其結(jié)構(gòu)的改變，其最強峰的位置和強度產(chǎn)生了一定變化，并且肽鈣螯合物的峰強度遠低于多肽的峰強度，峰形逐漸平緩并在λmemax=355 nm處的熒光峰消失。這些明顯的熒光光譜的變化表明螯合反應(yīng)可能是側(cè)鏈殘基基團相互作用所引起的，并且說明肽鈣螯合物是一種不同于多肽的物質(zhì)。

2.3.3 紅外光譜分析

圖 7 多肽（A）及肽鈣螯合物（B）的紅外光譜掃描圖譜Fig. 7 Infrared spectra of peptide (A) and peptide-calcium chelate (B)

由圖7可以看出，螯合前后紅外光譜圖譜發(fā)生了明顯變化，說明螯合反應(yīng)發(fā)生后，氨基酸基團的振動頻率發(fā)生了變化，從而引起了吸收峰明顯改變[24]。在多肽的紅外光譜特征區(qū)，1 632.68 cm-1屬于酰胺I帶，是由C＝O的伸縮振動所引發(fā)；1 458.23 cm-1處的振動屬于酰胺II帶，是由N—H鍵的面內(nèi)彎曲振動和C—N鍵的伸縮振動引起；由于多肽結(jié)構(gòu)的獨特性，既Gly-Pro-Hyp序列的存在，使得其在范圍內(nèi)具有其他蛋白質(zhì)所沒有的特征紅外光譜；1 037.78 cm-1處屬于（PtNH2）吸收峰；在599.34 cm-1以及564.02 cm-1則由于C＝O面外彎曲振動。而在添加了鈣離子后在1 546.91、1 408.97、1 340.59、1 240.10 cm-1等處新出現(xiàn)了一個較強的吸收峰，與羧酸成鹽后的變化相一致，1 546.91 cm-1處為羧酸根的反對稱伸縮振動，1 408.97 cm-1則為對稱伸縮振動；而在1 240.10 cm-1處出現(xiàn)了代表C—O單鍵伸縮振動的典型新峰，表明肽鈣螯合物中含有—NH2以及—COOH結(jié)構(gòu)[25]。在2 924.43 cm-1以及2 853.26 cm-1處的吸收峰反應(yīng)后向低波段處移動，而1 632.68 cm-1處則向高波段處移動，—COO—處附近有反對稱振動[26]。在1 037.78 cm-1出現(xiàn)了向低波段移動，且吸收峰增強，是由于此處為典型（PtNH2）吸收峰，證明鈣離子與—NH2之間存在一定的結(jié)合作用；上述峰位的轉(zhuǎn)移、消失，說明在羧基中的氧原子以及氨基中的氮原子是發(fā)生螯合反應(yīng)的主要配位原子，與此同時肽鍵也參與了螯合物的生成[27]。由此可以推斷多肽與鈣離子之間發(fā)生了螯合反應(yīng)，形成了螯合物。

2.3.4 粒徑以及穩(wěn)定性分析

圖 8 多肽及肽鈣螯合物的粒徑分布圖譜Fig. 8 Particle size distribution of peptide and peptide-calcium chelate

圖 9 多肽及肽鈣螯合物的穩(wěn)定性指數(shù)分布Fig. 9 Stability index distribution of peptide and calcium-peptide chelate

由圖8可知，經(jīng)螯合處理后，粒徑增加。原因在于小分子多肽與外源鈣離子相結(jié)合，以及自身之間也發(fā)生了結(jié)合，致使分子質(zhì)量增加，粒徑變大。由圖9可以看出，經(jīng)過螯合處理后穩(wěn)定性指數(shù)高于未經(jīng)過處理，其代表的穩(wěn)定性有所降低，而粒徑越大，穩(wěn)定性越低，穩(wěn)定性指數(shù)越高。二者相輔相成，證明了穩(wěn)定性指數(shù)與粒徑大小之間的關(guān)系，從而進一步說明，多肽以及肽鈣螯合物是兩種不同的物質(zhì)。

2.3.5 掃描電子顯微鏡分析

圖 10 多肽及肽鈣螯合物的掃描電子顯微鏡圖Fig. 10 Scanning electron micrographs of peptide and peptide-calcium chelate

從圖10可以看出，多肽結(jié)構(gòu)疏松，表面粗糙，凹凸不平，而經(jīng)過處理的螯合物則均勻分布著“溝槽裂痕”，這是由于螯合物經(jīng)冷凍干燥處理后形成的親水區(qū)，在空氣中吸潮造成的；并且在制樣過程中由于點樣噴金操作過程的存在，樣品極易吸水，之后在電子顯微鏡的真空環(huán)境中又快速失水干燥，因此留下痕跡；螯合物較多肽而言其表面更加光滑，結(jié)構(gòu)更緊密，是由于多肽與鈣離子通過離子鍵、配位鍵從而生成了小顆粒聚集體。

3 結(jié) 論

本研究選用骨肽與鈣進行螯合處理，綜合考慮鈣質(zhì)量分數(shù)及螯合率，自制得到有利于人體吸收的肽鈣螯合物。同時，對骨肽及其鈣螯合物進行紫外光譜、熒光光譜、傅里葉紅外光譜以及電子顯微鏡掃描，結(jié)果表明，較骨肽而言螯合物由于二價鈣離子與多肽發(fā)生了配位反應(yīng)、離子反應(yīng)以及一部分吸附作用，形成了更穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定差異，分屬于不同的物質(zhì)，較好地證明了鈣螯合物的形成，該實驗可為肽鈣螯合物實際應(yīng)用生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。