匡鳳元，吳光斌，張 珅，黃利娜，陳發(fā)河

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361000）

蓮霧（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill & L.M.Perry）又名洋蒲桃、甜霧等[1]，是來自桃金娘科蒲桃屬的熱帶水果[2]，原產(chǎn)于馬來半島，我國臺(tái)灣最早引入[3]。蓮霧果實(shí)富含酚類和類黃酮等物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。但是，蓮霧采后呼吸代謝旺盛，果肉易發(fā)生絮狀綿軟癥狀，造成品質(zhì)劣變而失去商業(yè)價(jià)值[5-6]。蓮霧貯藏期間木質(zhì)素代謝是造成采后果實(shí)絮狀綿軟癥狀的重要影響因素[7-9]。

木質(zhì)素是酚類聚合物，主要由苯丙烷代謝途徑生成。肉桂酸經(jīng)L-苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）催化脫氨基生成，在肉桂酸-4-羥化酶（trans-cinnamate 4-monooxygenase，C4H）、香豆酸-3-羥基化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）、阿魏酸-5-羥化酶（ferulate-5-hydroxylase，F(xiàn)5H）、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeic acid-O-methyltransferase，COMT）等關(guān)鍵酶的作用下生成對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等酚酸，酚酸繼續(xù)在苯丙烷代謝途徑中各種酶的作用下合成木質(zhì)素[10-11]。植物中的酚酸是以游離、游離的酯和共軛（結(jié)合）形式存在于果蔬中[12-13]。在這3 種形式中，游離和游離的酯酚酸是可溶性酚酸。游離酚酸可直接從甲醇、乙醇或丙酮中提??；游離酯是通過酯鍵與可溶性糖或小分子連接的酯；共軛酚酸通過酯鍵與細(xì)胞壁結(jié)合，酯鍵可以使用堿水解提取[14]。目前，果蔬中酚酸的測(cè)定方法主要有分光光度法[15]、氣相色譜法[16]和毛細(xì)管電泳法[17]等。分光光度法定量準(zhǔn)確性較差，只能用于同類型結(jié)構(gòu)酚酸類物質(zhì)含量的測(cè)定，不能區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的單一酚類物質(zhì)，而且易受樣品中其他雜質(zhì)的影響。氣相色譜法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、分離效能高等優(yōu)點(diǎn)，韓雪等[16]用氣相色譜法對(duì)紅棗中6 種酚酸進(jìn)行了定性和定量分析。但是酚酸類化合物屬于極性化合物，要對(duì)酚酸類化合物進(jìn)行氣相色譜分析并且獲得好的出峰效果，必須先通過衍生化處理以降低樣品極性，而衍生化時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致樣品中酚酸含量測(cè)定產(chǎn)生較大的誤差。毛細(xì)管電泳法雖然具有快速、高效、所需樣品量小等優(yōu)點(diǎn)，但是其重現(xiàn)性較差，不適用于酚酸的定量測(cè)定。而高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）不僅具有使用方便、準(zhǔn)確度高和高度重現(xiàn)性的優(yōu)點(diǎn)，而且可以區(qū)分結(jié)構(gòu)類似的單一酚酸類化合物，是目前測(cè)定酚酸類化合物常用的分析技術(shù)[18]。國內(nèi)外現(xiàn)有研究通過HPLC法測(cè)定了獼猴桃[21]、番茄[22]、火龍果[23]和荔枝[24]等水果中所含酚酸種類及含量；駱成堯等[19]運(yùn)用反相HPLC法同時(shí)測(cè)定馬鈴薯中的綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸含量，但是僅測(cè)定了馬鈴薯中的游離酚酸；饒國棟等[20]通過HPLC測(cè)定方法對(duì)煙草木質(zhì)素代謝途徑中相關(guān)植物酚酸進(jìn)行了研究。關(guān)于利用HPLC法同時(shí)測(cè)定蓮霧木質(zhì)素代謝途徑中5 種關(guān)鍵中間產(chǎn)物酚酸（肉桂酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸）的方法鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法同時(shí)測(cè)定采后蓮霧果實(shí)木質(zhì)素代謝途徑中5 種關(guān)鍵中間產(chǎn)物酚酸含量，探討這5 種酚酸在采后蓮霧中的含量變化，旨在為進(jìn)一步探究蓮霧果實(shí)貯藏期間木質(zhì)素代謝的調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以當(dāng)日抵達(dá)福建省廈門市中國臺(tái)灣水果集散中心的中國臺(tái)灣“黑珍珠”蓮霧（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill & L.M. Perry）為材料。選擇形狀大小、成熟度基本一致、沒有病蟲害且無機(jī)械損傷的蓮霧，置于恒溫恒濕箱中貯藏12 d（溫度（4±0.5）℃、相對(duì)濕度（85±2）%。

肉桂酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸對(duì)照品（純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Sigma公司；乙醇、乙酸、乙醚、乙酸乙酯（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695 HPLC儀（配2489 紫外檢測(cè)器） 美國Waters公司；高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Cary50紫外-可見分光光度計(jì) 美國Varian公司；RIOS 8超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；PE20K型pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；RE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；KQ數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲波儀器有限公司；LHS智能恒溫恒濕箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WB-14恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；LGJ冷凍干燥機(jī)北京松源華興科技發(fā)展有限公司；ULT1386 -80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

乙酸溶液（pH 2.4）：超純水用乙酸調(diào)節(jié)pH值至2.4，用0.45 μm的水相濾膜過濾后超聲。

單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：配制質(zhì)量濃度為800 mg/L的5 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品（肉桂酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸），-20 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量的各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇溶液稀釋至2、4、8、16、32、64 倍，得到梯度混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 樣品的提取

游離酚酸的提取：精密稱取蓮霧凍干粉末1 g，用20 mL甲醇在40 Hz常溫超聲提取30 min，之后10 000 r/min離心10 min，取上清液，共重復(fù)提取3 次，收集取得的上清液即為游離酚酸提取液。

結(jié)合酚酸的提取：參照Luo Chunying等[18]的方法進(jìn)行。將上述離心得到的沉淀加入25 mL提取液（24 mL 4 mol/L NaOH溶液＋0.4 mL 1%抗壞血酸溶液＋0.6 mL 10 mmol/L EDTA溶液），然后將其用氮?dú)獗Ｗo(hù)，密封并在室溫下攪拌約16 h。將反應(yīng)完成的溶液用4 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)至pH值為2，然后用15 mL乙醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V）的混合物萃取3 次，合并萃取液在10 000 r/min離心10 min，收集上清液為堿解所得到的結(jié)合酚酸提取液。繼續(xù)將上述離心沉淀在85 ℃用50 mL 4 mol/L HCl溶液水解30 min，待混合物冷卻后用4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值為2，然后用15 mL乙醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V）的混合物重復(fù)萃取3 次，合并萃取液在10 000 r/min離心10 min，收集上清液為酸解所得到的結(jié)合酚酸提取液。

將上述所得3 種粗提取液混合后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃旋蒸。蒸干后，用2 mL甲醇復(fù)溶，最后過0.22 μm微孔濾膜備用。

1.3.3 HPLC條件

色譜條件：InfinityLab Poroahell C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），流動(dòng)相為pH 2.4的乙酸溶液（A）-甲醇溶液（B），梯度洗脫（0～32 min，10%～20% B；32～40 min，20%～40% B；40～45 min，40% B；45～48 min，40%～10% B；48～55 min，10% B），柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長為320 nm和279 nm，進(jìn)樣量15 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用Adobe Photoshop軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

考察了Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和InfinityLab Poroahell C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）在pH 2.4乙酸溶液（A）-甲醇溶液（B）梯度洗脫條件下的分離效果。結(jié)果顯示，Atlantis T3色譜柱的分離效果稍差；而Symmetry C18柱和InfinityLab Poroahell C18色譜柱的分離效果較好。又因InfinityLab Poroahell C18色譜柱的柱子較短，分析時(shí)間短，節(jié)省流動(dòng)相和時(shí)間，且峰形較好，因此本實(shí)驗(yàn)選取InfinityLab Poroahell C18色譜柱。

2.2 檢測(cè)波長的選擇

5 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的紫外區(qū)全波長掃描結(jié)果顯示，肉桂酸在279 nm波長處有特征吸收，對(duì)香豆酸在290 nm波長處有特征吸收，其他3 種酚酸在320 nm波長左右區(qū)域有吸收峰，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選用279 nm和320 nm作為定量檢測(cè)波長。

2.3 流動(dòng)相體系的選擇

酚類物質(zhì)的HPLC分析常采用甲醇-水溶液或者乙腈-水溶液作為流動(dòng)相。由于流動(dòng)相B中水的比例過大，容易使有機(jī)酚酸類化合物發(fā)生電離，從而使色譜峰形拖尾變寬且不對(duì)稱。在流動(dòng)相中加入酸性抑制劑可以抑制這種化合物的電離，增大其分布系數(shù)，各組分色譜峰的峰形和分離度都得到明顯的改善，保留時(shí)間也相應(yīng)增加，而酸性抑制劑的種類、濃度以及流動(dòng)相組成都與分離效果有關(guān)。因此實(shí)驗(yàn)比較了pH值均為2.6的甲酸溶液、乙酸溶液、磷酸溶液對(duì)目標(biāo)組分的分離效果，結(jié)果顯示流動(dòng)相為甲酸溶液和磷酸溶液時(shí)，芥子酸和阿魏酸的分離度均小于1，而流動(dòng)相為乙酸溶液時(shí)，芥子酸和阿魏酸的分離度為1.2?？紤]到酸性抑制劑的濃度會(huì)影響色譜峰的分離度，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了乙酸溶液的pH值為2.4、2.5、2.6、2.7對(duì)5 種酚酸的保留時(shí)間及分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為2.4時(shí)芥子酸和阿魏酸的分離度大于1.5，滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此綜合以上條件選擇pH值為2.4的乙酸溶液為流動(dòng)相B。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，流動(dòng)相甲醇與乙腈的分離效果差不多，考慮到甲醇的價(jià)格較低和樣品的溶劑效應(yīng)，因此采用甲醇做為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)首先采用等度洗脫的方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)成分很難與干擾峰有效的分離，而采用梯度洗脫的方式，則有較大改善。當(dāng)采用1.3.3節(jié)梯度洗脫條件時(shí)，肉桂酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸5 個(gè)峰能與干擾峰有效的分離，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

在上述優(yōu)化的液相色譜條件下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，5 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品及蓮霧提取液的液相色譜圖見圖1、2，其相鄰峰的峰形較好，分離度較好。

圖 1 5 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品在279 nm（A）和320 nm（B）波長處的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 5 phenolic acid standards at 279 (A) and 320 nm (B)

圖 2 蓮霧提取液在279 nm（A）和320 nm（B）波長處的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of wax apple extract at 279 (A) and 320 nm (B)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限測(cè)定結(jié)果

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同質(zhì)量濃度的5 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定。以各酚酸組分的峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比確定檢出限（RSN＝3）以及定量限（RSN＝10）。如表1所示，5 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)范圍為0.999 4～0.999 9，檢出限為0.01～0.03 mg/kg，定量限為0.03～0.09 mg/kg。

表 1 酚酸組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges,limits of detection and limits of quantitation of phenolic acids

2.5 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果

向已知5 種酚酸含量的蓮霧樣品中分別加入高、中、低3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.2節(jié)方法處理。每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6 次，計(jì)算相應(yīng)組分的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表2。結(jié)果顯示，5 種酚酸的加標(biāo)回收率為86.18%～99.05%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，說明該方法精密度良好，準(zhǔn)確度高。

表 2 酚酸組分的加標(biāo)回收率（n=6）Table 2 Average recoveries of phenolic acids in spiked water (n= 6)

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

采用上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)采后蓮霧果實(shí)貯藏期間5 種酚酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3，5 種酚酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。蓮霧貯藏期間肉桂酸的含量不斷下降，含量變化范圍11.46～24.69 mg/kg、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸的含量變化趨勢(shì)為先上升后期下降，其含量變化范圍分別為0.92～1.45、2.31～5.32、8.86～20.58 mg/kg和9.48～22.62 mg/kg。已有研究表明酚酸濃度的變化取決于水果的成熟度，Seraglio等[25]發(fā)現(xiàn)樹葡萄、爪哇梅等蒲桃科植物的酚類化合物的最高濃度通常出現(xiàn)在中間成熟期。果實(shí)成熟收獲后開始出現(xiàn)軟化或者出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象，這與成熟過程中果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)降解和苯丙烷代謝等次生壁代謝有關(guān)，酚酸類物質(zhì)作為苯丙烷代謝途徑中木質(zhì)素合成的重要中間產(chǎn)物，很大程度影響果實(shí)中木質(zhì)素的合成。王斌[26]對(duì)碭山酥梨果實(shí)木質(zhì)素代謝的研究表明，梨果實(shí)發(fā)育后期阿魏酸和芥子酸含量大幅度降低，并且在木質(zhì)素合成高峰期下降速率最高。本研究測(cè)得采后蓮霧果實(shí)木質(zhì)素合成途徑中5 種酚酸含量的大小順序?yàn)槿夤鹚幔窘孀铀幔景⑽核幔究Х人幔緦?duì)香豆酸，并且它們的含量變化除肉桂酸在貯藏期間不斷下降外，其余4 種酚酸均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與采后蓮霧果實(shí)木質(zhì)素含量增加及絮狀綿軟進(jìn)程相一致，此結(jié)果也與Elmastas等[27]和王斌[26]在其他果實(shí)上的檢測(cè)結(jié)果類似。酚酸含量的變化說明更多的木質(zhì)素合成前體進(jìn)入到木質(zhì)素合成途徑中，使木質(zhì)素含量升高，最終導(dǎo)致果實(shí)木質(zhì)化現(xiàn)象加重。

表 3 樣品中5 種酚酸含量（n=3）Table 3 Contents of five phenolic acids in stored wax apple samples (n= 3)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助酸堿水解法，最大限度地提取了蓮霧果實(shí)中的游離及結(jié)合酚酸類化合物，并實(shí)現(xiàn)了利用HPLC法對(duì)蓮霧果實(shí)木質(zhì)素合成途徑中肉桂酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸5 種關(guān)鍵酚酸類化合物的同時(shí)定量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法，采用InfinityLab Poroahell C18色譜柱為固定相，以甲醇和乙酸溶液（pH 2.4）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測(cè)器波長279 nm和320 nm。各酚酸組分的線性范圍較寬，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 9，檢出限為0.01～0.03 mg/kg，定量限為0.03～0.09 mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，加標(biāo)回收率為86.18%～99.05%。測(cè)定了采后蓮霧貯藏期間5 種酚酸的含量變化，結(jié)果表明，貯藏期間肉桂酸的含量不斷下降，含量變化范圍為11.46～24.69 mg/kg，對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸的含量變化趨勢(shì)為先上升后期下降，其含量變化范圍分別為0.92～1.45、2.31～5.32、8.86～20.58 mg/kg和9.48～22.62 mg/kg。

酚酸類化合物是一組復(fù)雜多樣的二級(jí)植物代謝物，分為游離和結(jié)合方式存在[28]。文獻(xiàn)中大多以甲醇或丙酮直接萃取獲得酚酸提取液，忽視了結(jié)合酚酸的提取，往往造成酚酸類物質(zhì)的定性和定量不準(zhǔn)確[19-20]。同時(shí)，酚酸類化合物作為木質(zhì)素代謝途徑中的重要中間產(chǎn)物，很大程度上影響果實(shí)中木質(zhì)素的合成[29-30]。酚酸的定性和定量分析是開展木質(zhì)素代謝研究的基礎(chǔ)[31]。本研究建立的利用HPLC法分析采后蓮霧果實(shí)木質(zhì)素合成途徑中酚酸的方法使5 種酚酸得到很好的分離，準(zhǔn)確度和精密度好，靈敏度和回收率高，操作簡(jiǎn)便。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究蓮霧果實(shí)貯藏期間木質(zhì)素代謝的調(diào)控機(jī)理提供參考。