方艾虎，李凌云，楊宗蘊，徐幸蓮，王越溪，王 鵬

（南京農(nóng)業(yè)大學 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095）

蛋白質(zhì)是參與、形成穩(wěn)定水包油乳液的一類重要物質(zhì)。乳液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)關系到食品的保質(zhì)期、質(zhì)地和口感等[1]，而乳液中液滴的絮凝直接影響乳液結(jié)構(gòu)，以及乳液中的界面穩(wěn)定和液滴合并。影響液滴絮凝的一些變量包括油相體積分數(shù)、蛋白質(zhì)/油的比率、平均粒徑等[2]。在高濃度乳液體系中，液滴絮凝擠壓作用和液滴間吸引力互相協(xié)調(diào)，引起的結(jié)構(gòu)化使得乳液表現(xiàn)出塑性或黏彈性[3]。

亞麻籽油是常用的營養(yǎng)脂質(zhì)來源，含有高達50%以上的α-亞麻酸[4]。此外，α-亞麻酸作為一種主要的n-3脂肪酸對大腦發(fā)育、視覺視力和免疫系統(tǒng)都起著重要的作用[5]。因此，近些年國內(nèi)研究學者對亞麻籽油的加工利用進行了研究[6-7]。

國內(nèi)[8]已經(jīng)有部分學者對高濃度乳液內(nèi)部的油滴絮凝與乳化劑[9-10]的交聯(lián)進行研究，主要集中在低濃度乳液到高濃度乳液（油相質(zhì)量分數(shù)為20%～60%）過程中乳液的流變性質(zhì)與微觀結(jié)構(gòu)的變化，國外[11-12]部分學者也為乳液內(nèi)部一定的多糖、蛋白質(zhì)量分數(shù)造成乳液內(nèi)部液滴絮凝對乳液的穩(wěn)定性與性能的進行了研究。然而國內(nèi)對較高油相質(zhì)量分數(shù)的高濃度乳液的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)研究較少。因此本研究以亞麻籽油作為分散相，卵清分離蛋白溶液作為連續(xù)相對高濃度乳液（油相質(zhì)量分數(shù)為69%～85%）的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進一步測定，包括流變性質(zhì)、粒徑分布、電導率以及激光共聚焦觀察等，旨在為高濃度乳液的制備及其在酸奶、加工肉制品等中的應用提供實驗依據(jù)，從而為高質(zhì)量、高穩(wěn)定性的乳狀食品開發(fā)及卵清分離蛋白的新利用方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵清分離蛋白粉（水分≤8.0%；蛋白質(zhì)≥78.0%） 吉林金翼蛋品有限公司；亞麻籽油（壓榨一級，2.456 L）錫林郭勒盟紅井源有限責任公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國藥集團化學試劑有限公司；Nile Red和Nile Blue（硫酸耐爾藍） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar公司；Mastersizer 3000激光粒度儀 英國Malvern公司；PD500-TP高性能分散勻漿機 英國Prima公司；激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司；SensoDirect Con 200型電導率儀 德國Tintometer GmbH公司；MX-F固定式混勻儀 大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液的制備

卵清分離蛋白粉（6%）與去離子水定量混合，通過混勻儀將蛋白粉均勻分散在去離子水中，靜置1 h使其充分水合溶解；此溶液作為高濃度乳液的連續(xù)相。向連續(xù)相中分別加入質(zhì)量分數(shù)為65%、70%、75%、80%、85%的亞麻籽油，用振蕩器將兩相均勻混合；用分散勻漿機以13 500 r/min的轉(zhuǎn)速剪切2.5 min（每30 s間隔10 s）制成高濃度乳液[13]，所得乳液樣品放入冰桶中迅速降至室溫。

1.3.2 乳液表觀黏度的測定[13]

使用MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀測定乳液的表觀黏度。將乳液均勻涂布在50 mm的平板上，除去涂抹時產(chǎn)生的氣泡，測試平板間的上下狹縫為0.5 mm，待穩(wěn)定30 s，測試溫度達到25 ℃后開始測試?？偧羟袝r間330 s，記錄在0.1～1 000 s-1剪切速率下卵清分離蛋白高濃度乳液的表觀黏度變化。

1.3.3 乳液儲能模量和損耗模量的測定

利用MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀測定乳液的儲能模量G’和損耗模量G’’。測試平板的直徑為50 mm，上下平板間距為1 mm，測試溫度為25 ℃，應力為1%，角頻率為1～100 rad/s，樣品為在4 ℃冷庫中放置12 h的卵清分離蛋白高濃度乳液[14]。

1.3.4 乳液的粒徑分布

利用Mastersizer 3000激光粒度儀對高濃度乳液的粒徑大小分布進行測定。取1 mL的蛋白乳液加入3 mL質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的SDS溶液中，用渦旋振蕩器一擋渦旋溶液10 s后測定乳液粒徑分布。在此測試中，分散劑為水且折射率為1.330；顆粒折射率參數(shù)為1.414；顆粒吸收率為0.001；顆粒的分析模式為球形[15-16]。

1.3.5 乳液電導率的測定

使用SensoDirect Con 200型電導率儀分別對亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為65%、70%、75%、80%、85%的卵清分離蛋白高濃度乳液進行電導率的測定，記錄不同油相質(zhì)量分數(shù)下乳液電導率的變化情況[17]。

1.3.6 乳液的外觀

使用SONY ILCE-6000L照相機對乳液進行拍照。

1.3.7 乳液的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)

采用共聚焦顯微鏡對乳液進行觀察。蛋白乳液樣品是用0.1%的Nile Bule A和0.02%的Nile Red進行染色，其中Nile Blue A對蛋白進行染色，Nile Red對油脂進行染色。染色時，每50 g乳液加入各1.2 mL的兩種染色劑，染色過程需避光。染色后的乳液需避光在4 ℃冷庫進行振蕩過夜，以保證乳液的充分染色。將染色后的乳液取一部分小心加到載玻片上，并覆蓋蓋玻片。載玻片上的樣品要涂抹均勻，除去不小心產(chǎn)生的氣泡。將制好的樣品放在載物臺上，物鏡轉(zhuǎn)換為40×油鏡，迅速在488 nm與633 nm激發(fā)光波長處采集圖像，防止熒光焠滅[18]。得到的圖片使用Image J V1.47進行處理，用Image J V1.47中的粒徑分析功能進行測定，得到乳液油滴的費雷特直徑與平均粒徑[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗重復3 次，結(jié)果以 ±s表示。采用Origin 8.0進行作圖與分析，運用SAS V8軟件中的ANOVA進行方差分析，比較樣品數(shù)據(jù)間的顯著性差異，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 油相質(zhì)量分數(shù)對乳液表觀黏度的影響

在高質(zhì)量分數(shù)乳化體系中，由于油相質(zhì)量分數(shù)很高，油滴間間距很小，會產(chǎn)生類似于膠體粒子的絮凝現(xiàn)象。但乳液液滴之間主要通過油滴界面層蛋白之間的氫鍵等作用，產(chǎn)生相互影響[20]。在較高的油相比例且均一分散時，強烈的絮凝作用下甚至可能呈現(xiàn)緊密壓縮的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[21]。但當剪切速率過大時，過高的能量輸入會對已聚集液滴的擾動使得緊密壓縮結(jié)構(gòu)破壞，造成黏度降低[22]。

圖 1 不同油相質(zhì)量分數(shù)的高濃度乳液樣品黏度分布Fig. 1 Viscosity distribution of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

如圖1所示，在剪切速率0.1～1 000 s-1范圍內(nèi)，卵清分離蛋白高濃度乳液的表觀黏度隨剪切速率的增大而下降，即發(fā)生了剪切變稀現(xiàn)象。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，在亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為65%、70%、75%時，乳液的黏度隨著乳化物中亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)的提高而增加。一方面，隨著亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)的增加，乳液由于相鄰油滴的絮凝形成網(wǎng)絡而具有更高的黏度；在較高的油質(zhì)量分數(shù)下，油滴之間較大的接觸表面積阻礙了剪切場中乳液的自由流動，增加了乳液黏度。另一方面，隨著乳液中水分比例的減少，連續(xù)相中蛋白比例升高，乳液中蛋白質(zhì)之間相互作用增強，這極大地提高了連續(xù)相的黏度，乳化油滴不能在高黏度網(wǎng)絡中自由的移動，從而提高了乳液的黏度與穩(wěn)定性[23-24]。實驗參考Kato等[25]的方法，采用ANS熒光探針法測定蛋白表面疏水性。當?shù)鞍踪|(zhì)量濃度在1～6 g/100 mL范圍內(nèi)，連續(xù)相在激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長460 nm處的熒光強度從3 800增長到17 096（圖略）。隨著連續(xù)相中蛋白質(zhì)量濃度增大，疏水基團暴露較多，連續(xù)相的疏水性增大，表面電荷數(shù)增多，乳液更加穩(wěn)定，即連續(xù)相中的蛋白質(zhì)分子之間的連接更加緊密，使得連續(xù)相黏度增大，乳液表觀黏度增大[26]。在亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為80%時，乳液連續(xù)相比例的進一步降低導致乳液中蛋白絮凝程度增加，油滴從其正常的球形變形擠壓成為多邊形，聚集乳液油滴，乳液呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)，其黏度降低。亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為85%的乳液黏度遠低于其他亞麻籽油的乳液黏度，這是由過量的卵清分離蛋白聚集，破壞了乳液的結(jié)構(gòu)化，導致了空缺絮凝，從而大部分的油沒有得到乳化造成的。

2.2 乳液的G’和G’’

應用G’和G’’進行不同油相質(zhì)量分數(shù)高濃度乳液的變形流變特性研究。G’反映乳液的彈性性質(zhì)，G’’反映乳液的黏性性質(zhì)[27]。

圖 2 不同油相質(zhì)量分數(shù)的高濃度乳液樣品G’和G”分布Fig. 2 Storage and loss modulus distribution of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

如圖2所示，所有卵清分離蛋白乳液樣品在本實驗所考察的角頻率范圍內(nèi)，G’和G’’在角頻率達到20 rad/s后，隨頻率增加無顯著變化。G’遠高于G’’，表明這些油相質(zhì)量分數(shù)的卵清分離蛋白高濃度乳液都呈現(xiàn)出彈性為主的凝膠性質(zhì)[28]，可以認為圖中所有的卵清分離蛋白高濃度乳液均形成凝膠狀乳化物，對乳液中蛋白的疏水性進行測定時發(fā)現(xiàn)在亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為65%、70%、75%時，高質(zhì)量分數(shù)蛋白乳液稀釋到同一質(zhì)量分數(shù)后，乳液內(nèi)蛋白熒光強度從6 055降低到2 813，乳液內(nèi)蛋白疏水性隨著油相質(zhì)量分數(shù)的升高而降低，由于更多的蛋白質(zhì)與油脂發(fā)生疏水作用結(jié)合，導致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的折疊，使疏水基團包埋[29]，因此表面疏水性下降，說明在高濃度乳液中，更多分散的油滴被包埋或整合進乳液凝膠網(wǎng)絡中，使乳液的G’更高，乳液G’和G’’受到角頻率的影響較小，總體趨勢趨于平緩。

從圖2可以看出，在添加65%、70%、75%、80%亞麻籽油的卵清分離蛋白高濃度乳液中，G’和G’’都得到了顯著提高，這與圖1中黏度變化趨勢相符合。在65%、70%、75%、80%油相質(zhì)量分數(shù)下，G’和G’’都隨角頻率的提高而略有提升；并且在同一頻率下，乳液的G’和G’’隨乳液中油相比例的提高而增大，這也表明油滴粒子在乳液中起到活性填充顆粒的作用[14]。

2.3 乳液的粒徑分布

乳液中的油相經(jīng)過高速剪切后，大的油滴被破碎成小的油滴，并被卵清分離蛋白包裹，使其分散在連續(xù)相之中。乳液中油滴的粒徑大小是影響乳液穩(wěn)定性及性質(zhì)的一個重要指標，能直觀地展示乳液中油滴的狀態(tài)[30]。SDS是一種良好的抗絮凝劑，可將乳液中絮凝的油滴分散于連續(xù)液中的油滴的粒徑越小，形成的油滴絮凝更加致密緊湊，乳液的物理穩(wěn)定性越好。

圖 3 油相質(zhì)量分數(shù)對高濃度乳液樣品粒徑分布的影響Fig. 3 Effect of different oil phase concentrations on particle size distribution of high-concentration emulsions

如圖3所示，亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為65%、70%、75%、80%的高濃度乳液，其粒徑隨著油相比例的提高而減小，且都呈現(xiàn)出雙峰分布。油滴粒徑減小有利于乳液內(nèi)部油滴粒子的穩(wěn)態(tài)化，抵抗外界環(huán)境的變化而不至于聚集成大的油滴而分層。隨著油相質(zhì)量分數(shù)的增加，乳液油滴粒徑減小的趨勢與圖2得到的乳液G’和G’’增加具有相關性，這可能是因為在本研究的小變形流變測試中，更小油滴的相互排斥或油滴的擠壓導致膠體體系產(chǎn)生更高的應力[31]。

2.4 乳液的電導率分析

亞麻籽油是一種非極性溶劑，在20 ℃其電導率為0 μS/cm。高濃度乳液連續(xù)相用的去離子水的電導率大約為14.5 μS/cm。從圖4可以看出，卵清分離蛋白高濃度乳液的電導率遠高于亞麻籽油的電導率，這表明實驗中的高濃度乳液是用亞麻籽油分散在蛋白水溶液中形成的。

圖 4 油相質(zhì)量分數(shù)對高濃度乳液樣品電導率的影響Fig. 4 Effect of different oil phase concentrations on conductivity of high-concentration emulsions

從圖4可以看出，在亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為65%、70%、75%、80%時，高濃度乳液的電導率隨乳液中亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)的增加而逐漸下降，這種下降可以認為一方面由于乳液中亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)升高，油滴粒徑變小，表面面積增大，油滴之間的蛋白質(zhì)薄膜越來越??；另一方面由于亞麻籽油含量的增高，乳液中電荷流動移動難度增大[17,32]。當乳液中亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)達到85%時，乳液的電導率迅速下降到82.5 μS/cm，原因在于此時乳液中的連續(xù)相中蛋白質(zhì)量分數(shù)太高，出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集造成乳液中產(chǎn)生部分油包水與相分離現(xiàn)象。進一步實驗觀察發(fā)現(xiàn)，亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為85%的乳液隨著靜置的時間延長，乳液的相分離加大，乳液底端的蛋白質(zhì)絮狀物增多，從而電導率值增大。

2.5 乳液的外觀形態(tài)

乳化的剪切設置、蛋白質(zhì)與油的比例，是制備細小液滴和比較窄的粒徑分布的穩(wěn)定乳液的重要影響因素[33]。如圖5所示，在乳化條件一定時，不同的油相比例所得的乳液的形態(tài)是不同的。在圖5A～D中，隨著乳液中油相比例的升高，可以看到乳液從流態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的表觀形態(tài)。這是由于當乳液油相質(zhì)量分數(shù)較高時，覆蓋了蛋白膜的油滴便變成活性填充物，均勻填充分散在連續(xù)相之中，從而增強了高濃度乳液的硬度；此時蛋白質(zhì)的構(gòu)象也可能發(fā)生變化，其疏水殘基充分暴露，加強了蛋白質(zhì)與油滴之間的相互作用[34]。

而如果乳液在乳化過程中存在過量未吸附的蛋白質(zhì)，則可能形成聚集油滴。如圖5E所示，此時乳液亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為85%，隨之乳液中水分比例變得很少，蛋白無法充分溶解造成乳液中出現(xiàn)中大量未參與結(jié)構(gòu)化的蛋白，從而造成了空缺絮凝，大量蛋白聚集到一起與油相分離[35]。

圖 5 不同油相質(zhì)量分數(shù)的高濃度乳液樣品表觀形態(tài)Fig. 5 Apparent morphology of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

2.6 乳液的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖 6 乳液的共聚焦顯微鏡圖Fig. 6 Confocal micrographs of emulsions with different oil phase concentrations

如圖6所示，卵清分離蛋白高濃度乳液的微觀結(jié)構(gòu)與亞麻籽油的質(zhì)量分數(shù)有關，隨著油相比例的升高，乳液內(nèi)油滴會發(fā)生聚集、絮凝，并有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，乳液油滴的粒徑隨著油相質(zhì)量分數(shù)的增加而減小，并且油滴之間相互擠壓。圖6C中油滴由于擠壓，呈現(xiàn)出多邊形的形狀，此時的乳液的彈性相應增加，與G’和G’’的測定結(jié)果相同；抵抗機械力和連續(xù)相分離的能力增強。而在圖6D中，亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)達到80%，油滴粒徑分布很不均勻，有很多1 μm左右的油滴凝絮在一起，也有部分未被乳化的油滴。在高濃度乳液中較小的油滴具有較高的界面區(qū)域，可以為蛋白質(zhì)的吸附提供較多位點，從而增強油滴與基質(zhì)的結(jié)合作用，提高乳液的穩(wěn)定性與彈性[36]。此外，由于乳液連續(xù)相中蛋白質(zhì)量分數(shù)太高（圖6D），造成大量蛋白交聯(lián)在一起因此有效地阻礙了油滴的聚結(jié)，交聯(lián)聚合的蛋白質(zhì)使得乳液呈現(xiàn)凝膠狀[37]。

用Image J V1.47中的粒徑分析功能對乳液的激光共聚焦圖像進行分析，測定乳液油滴的費雷特直徑。如表1所示，在亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)65%～80%范圍內(nèi)，乳液的平均粒徑隨油相質(zhì)量分數(shù)的提高而減小，這與圖3結(jié)果相符合。而當乳液中蛋白質(zhì)與油脂比例改變，乳液內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)會發(fā)生相應變化。隨著油相質(zhì)量分數(shù)的升高，乳液連續(xù)相中蛋白質(zhì)的比例較高時，蛋白質(zhì)會發(fā)生自聚集，部分絮凝狀態(tài)的蛋白質(zhì)聚集體未參與整體的結(jié)構(gòu)化，以及起到固定和保持高濃度乳液特征性緊密壓縮形態(tài)的作用[38]；與此同時，連續(xù)相中有效吸附蛋白的減少使油滴聚集形成大的油滴（圖6D）。

表 1 不同油相質(zhì)量分數(shù)下乳液的平均粒徑Table 1 Average particle sizes of emulsions with different oil phase concentrations

3 結(jié) 論

本研究以卵清分離蛋白為連續(xù)相、亞麻籽油為分散相，通過高速剪切制備卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液。亞麻籽油質(zhì)量分數(shù)為65%～75%時，油相質(zhì)量分數(shù)的提高可使卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液中黏度、G’和G’’提高，乳液平均粒徑減小以及電導率的下降，表明蛋白質(zhì)界面膜變薄，乳液穩(wěn)定性增強。油相質(zhì)量分數(shù)為80%時，乳液黏度與平均粒徑變小，但粒徑分布變寬，蛋白交聯(lián)聚結(jié)增加了乳液連續(xù)相的彈性，乳液向凝膠轉(zhuǎn)化；與此同時，部分油滴的聚集形成了粒徑較大的油滴，這也是乳液粒徑分布變寬的原因。油相質(zhì)量分數(shù)為85%時，乳液中黏度、G’和G’’都顯著降低，乳液粒徑顯著變大；在乳液中存在大量未乳化的油滴，蛋白質(zhì)無規(guī)則聚集與油形成松散絮狀物，蛋白質(zhì)與油相分離。由此可見，在高油相質(zhì)量分數(shù)下制備卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液具備很好的可行性，其良好的穩(wěn)定性與高油相比例為今后高濃度乳液在食品領域中的應用提供依據(jù)和參考。