孫彬栩，蔡啟亮，李小江，賈英杰

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300381；2．天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211）

前列腺癌是一類從不需要治療的非侵襲性、生長緩慢的疾病到需要治療的侵襲性、生長迅速的疾病。據(jù)2019年最新數(shù)據(jù)顯示，在美國，前列腺癌是常見的腫瘤疾病之一，也是美國男性腫瘤死亡的第二大原因；預(yù)計(jì)將有174 650例男性被診斷出患有前列腺癌，31 620例患者將死于這種疾病[1]，從1993年到2016年，美國的前列腺癌病死率下降了51%，這主要是由于早期發(fā)現(xiàn)和改進(jìn)的治療[2]。在中國，前列腺癌的發(fā)病率雖遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美國家，但其發(fā)病呈快速上升趨勢[3]。中國大多數(shù)前列腺癌患者在初診時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，目前晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的一線治療方案仍然為內(nèi)分泌治療，但經(jīng)過中位時(shí)間為18～24個(gè)月的內(nèi)分泌治療，幾乎所有患者都將進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）[4]，而其中86%的CRPC最終會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)移性CRPC?；颊咭坏┻M(jìn)入CRPC階段，預(yù)后一般較差。因此，CRPC的診治一直是臨床與基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[5]。

目前，西醫(yī)學(xué)治療轉(zhuǎn)移性CRPC患者的方案包括：雄激素合成抑制劑-醋酸阿比特龍聯(lián)合低劑量醋酸潑尼松、抗雄激素藥-恩雜魯胺、多西他賽等[4]。國際多中心隨機(jī)雙盲試驗(yàn)（COU-AA-302）結(jié)果也顯示阿比特龍作為一線藥物可顯著延長未化療轉(zhuǎn)移性CRPC患者的中位生存期，延緩患者的疾病進(jìn)展，改善患者的生活質(zhì)量，且具有良好的安全性[6]。但是醋酸阿比特龍的使用也為患者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]，另外，亦有研究數(shù)據(jù)顯示阿比特龍和恩雜魯胺具有交叉耐藥性[8]。另外，現(xiàn)在患者關(guān)注的不僅僅是延長腫瘤患者的生命期，更為關(guān)心的是腫瘤對(duì)患者自身疼痛和生活質(zhì)量的影響。因此，如何利用中醫(yī)學(xué)的治療特色為CRPC患者制定最佳的治療方案，成為當(dāng)下治療的研究重點(diǎn)。

賈英杰教授[9]分析前列腺癌中醫(yī)證候相關(guān)文獻(xiàn)得出，前列腺癌的病變臟腑主要責(zé)之腎與膀胱，并涉及肝、脾、肺。基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)[10]，總結(jié)出前列腺癌病機(jī)為脾虛濕困、氣虛毒瘀，將治療前列腺癌的臨床驗(yàn)方進(jìn)行加減化裁，創(chuàng)立健脾利濕化瘀方，基礎(chǔ)方由黃芪、大黃、姜黃、王不留行等中藥組成。此外，在實(shí)驗(yàn)研究中均證實(shí)健脾利濕化瘀方及其各拆方組對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞荷瘤小鼠具有抑瘤作用[11]，并能抑制人前列腺癌C4-2細(xì)胞雄激素非依賴性生長作用[12]，為健脾利濕化瘀方的機(jī)制研究方面提供依據(jù)。多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞均可分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）類，在組織重塑中發(fā)揮重要作用，并與形態(tài)發(fā)生、血管生成等多種生理過程相關(guān)；這些酶類可有效降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而有助于腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。為進(jìn)一步明確該復(fù)方的作用機(jī)制[14]，在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用各拆方組含藥血清進(jìn)行前列腺癌DU-145、PC-3細(xì)胞的增殖與遷移影響研究，并選出細(xì)胞增殖率最佳的拆方組進(jìn)行基于胰島素樣生長因子（IGF）/MMP信號(hào)通路的分子機(jī)制研究，以更好地證實(shí)復(fù)方的部分作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的PC-3、DU-145、CAF細(xì)胞株購自ATCC公司，批號(hào)CRL-1435，由南開大學(xué)生命科學(xué)院分子研究所長期凍存。

1.2 試劑與藥品 健脾利濕化瘀方各拆方組含藥血清[11]由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腫瘤研究所凍存。其中，健脾扶正組藥物由黃芪、刺五加、補(bǔ)骨脂組成，化瘀散結(jié)組藥物由姜黃、大黃、王不留行組成，清熱解毒組藥物由白英、蛇六谷、車前草組成。

青霉素、鏈霉素、胎牛血清、L-谷氨酰胺、DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、四甲基噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（Chemicon，美國）等。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置熒光顯微鏡（美國BIGCO公司）及細(xì)胞培養(yǎng)皿（上海晶睿生物科技有限公司）等。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、DU-145、CAF常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿瓶底85%～90%，棄去已用培養(yǎng)液，以0．25%胰蛋白酶消化，隔2～3 d分瓶傳代、培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞生長抑制和最適藥物濃度 將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按5 000/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，24 h后除去培養(yǎng)液，分別將健脾扶正組、化瘀散結(jié)組、清熱解毒組含藥血清用培養(yǎng)基稀釋10、50、100倍加入96孔板中，每孔200 μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)；24 h 后加入八肽膽囊收縮素（CCK-8）溶液 20 μL，繼續(xù)孵育 4 h 后，測量各孔450 nm處的光密度值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取各組值的均數(shù)表示細(xì)胞的增殖情況。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 在Matrigel Invasion Chamber上室和下室各加入500 μL預(yù)熱的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中水化2 h；吸棄上下室中的無血清培養(yǎng)基，常規(guī)制備無血清1%雙抗DMEM單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 2×104/mL。

DU-145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞各分兩組：對(duì)照組和藥物組。對(duì)照組每孔上室中加入500 μL正常DMEM細(xì)胞懸液，藥物組每孔上室中加入500 μL化瘀散結(jié)組含藥血清培養(yǎng)基稀釋液，下室中加入750μL完全高糖DMEM培養(yǎng)基，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。固定、結(jié)晶染色，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)、拍照。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接入6孔板，數(shù)量以貼壁后鋪滿板底為宜；細(xì)胞鋪滿板底后用200 μL槍頭制造細(xì)胞劃痕；PBS漂洗；加入化瘀散結(jié)組含藥血清培養(yǎng)基稀釋液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下拍照記錄，計(jì)算劃痕愈合率。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-Time PCR）檢測前列腺癌細(xì)胞樣本中目的基因表達(dá)量的變化 化瘀散結(jié)藥物含藥血清設(shè)正常劑量組、低劑量組（稀釋100倍）、中劑量組（稀釋50倍）、高劑量組（稀釋10倍），每組3個(gè)樣本量。引物設(shè)計(jì)：SDF-1-F、SDF-1-R、IGF-1-F、IGF-1-R、MMPS-F、MMPS-R、FN-F、FN-R、Actin-F、Actin-R。用超純RNA提取試劑（TaKaRa Code D9108B）提取經(jīng)化瘀散結(jié)組含藥血清培養(yǎng)基稀釋液處理的CAF細(xì)胞樣本中總RNA，RNA質(zhì)量檢測、電泳、消化；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa code DRRO47A）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

2.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取化瘀散結(jié)藥物組（含藥血清培養(yǎng)基稀釋液）處理前列腺活化間質(zhì)細(xì)24 h，收集、破碎細(xì)胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠，蛋白樣品變性、電泳，凝膠轉(zhuǎn)膜及檢測。將一抗用封閉液稀釋（IGF-1抗體稀釋度均為1∶500，內(nèi)參抗體稀釋度為1∶1 000）。將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應(yīng)過夜；二抗室溫反應(yīng)1 h，曝光及洗片。測定各個(gè)條帶和內(nèi)參（β-肌動(dòng)蛋白）的灰度值，并計(jì)算比值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 23．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以 P＜0．05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 MTT法檢測細(xì)胞生長抑制和最適藥物濃度 含藥血清設(shè)置不同濃度（濃度分別為10、20、100mg/mL），經(jīng)過作用DU-145、PC-3細(xì)胞24 h后，與健脾扶正組、清熱解毒組相比，化瘀散結(jié)組抑制率高（P＜0．01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈一定的劑量依賴性抑制作用。見表 1、2及圖 1、2。

表1 不同濃度藥物對(duì)DU-145細(xì)胞抑瘤率比較（±s）Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on DU-145 cells（±s）%

表1 不同濃度藥物對(duì)DU-145細(xì)胞抑瘤率比較（±s）Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on DU-145 cells（±s）%

注：與健脾扶正組比較，*P＜0．01；與清熱解毒組比較，#P＜0．01。

組別 濃度10 mg/mL 20 mg/mL 100 mg/mL健脾扶正組化瘀散結(jié)組清熱解毒組n 6 6 6 0．20±0．08 4．10±1．02 53．40±2．01 19．80±1．36 39．90±1．84 91．40±2．57*#5．00±1．32 7．40±1．01 19．90±1．43

表2 不同濃度藥物對(duì)PC-3細(xì)胞抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on PC-3 cells（±s）%

表2 不同濃度藥物對(duì)PC-3細(xì)胞抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on PC-3 cells（±s）%

注：與健脾扶正組比較，*P＜0．01；與清熱解毒組比較，#P＜0．01。

組別 n 濃度1 0 m g/m L 2 0 m g/m L 1 0 0 m g/m L健脾扶正組 6化瘀散結(jié)組 6清熱解毒組 6-1 1．9 0±0．9 4 -1 2．1 0±1．0 1 7 7．4 0±2．6 7 1 8．8 0±1．0 2 5 8．9 0±1．8 4 8 7．3 0±2．4 2*#1．3 0±0．5 3 6．1 0±1．0 6 3 1．0 0±1．7 3

圖1 不同濃度藥物對(duì)DU-145細(xì)胞的抑瘤率（n=6）Fig.1 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on DU-145 cells（n=6）

圖2 不同濃度藥物對(duì)PC-3細(xì)胞的抑瘤率（n=6）Fig.2 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on PC-3 cells（n=6）

研究結(jié)果顯示，健脾利濕化瘀方的各有效拆方組中，化瘀散結(jié)組藥物的抑瘤率最高，為進(jìn)一步細(xì)化復(fù)方的研究機(jī)制，從化瘀散結(jié)組藥物入手進(jìn)一步深化研究其可能的分子機(jī)制。

3.2 Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力 與空白對(duì)照組相比，化瘀散結(jié)組含藥血清作用后的各組DU-145和PC-3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組漏入下室細(xì)胞數(shù)分別為（7．33±2．51）個(gè)和（3．67±0．58）個(gè)，顯著少于對(duì)照組（22．00±2．65）個(gè)和（22．67±7．77）個(gè)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。提示化瘀散結(jié)藥物能抑制 PC-3、DU-145細(xì)胞的侵襲能力。見表3-6和圖3-4。

表3 DU-145細(xì)胞各組之間侵襲細(xì)胞數(shù)結(jié)果Tab.3 Result of invading cells’number of DU-145 cells of each group 個(gè)

表4 DU-145細(xì)胞各組之間侵襲細(xì)胞數(shù)比較（±s）Tab.4 Comparison of invading cells’number of DU-145 cells of each group（±s） 個(gè)

表4 DU-145細(xì)胞各組之間侵襲細(xì)胞數(shù)比較（±s）Tab.4 Comparison of invading cells’number of DU-145 cells of each group（±s） 個(gè)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．01。

組別 n 侵襲細(xì)胞數(shù)對(duì)照組 3 22．00±2．65化瘀散結(jié)藥物含藥血清組 3 7．33±2．51*

表5 PC-3細(xì)胞各組之間侵襲細(xì)胞數(shù)結(jié)果Tab.5 Result of invading cells’number of PC-3 cells of each group 個(gè)

表6 PC-3細(xì)胞各組之間侵襲細(xì)胞數(shù)比較（±s）Tab.6 Comparison of invading cells’number of PC-3 cells of each group（±s） 個(gè)

表6 PC-3細(xì)胞各組之間侵襲細(xì)胞數(shù)比較（±s）Tab.6 Comparison of invading cells’number of PC-3 cells of each group（±s） 個(gè)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．01。

組別 n 侵襲細(xì)胞數(shù)對(duì)照組 3 22．67±7．77化瘀散結(jié)藥物含藥血清組 3 3．67±0．58*

圖3 DU-145細(xì)胞各組之間侵襲細(xì)胞情況Fig.3 Situation of invading cells of DU-145 cells of each group

3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力 與陰性對(duì)照組相比，化瘀散結(jié)藥物作用后的DU-145、PC-3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞遷移能力受到抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化瘀散結(jié)藥物含藥血清組能顯著抑制DU-145、PC-3細(xì)胞的遷移能力。見表7-10、圖5-6。

表8 DU-145細(xì)胞遷移距離比較（±s）Tab.8 Comparison of migration distance of DU-145 cells（±s） μm

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．01。

組別 n 遷移距離對(duì)照組 2 759．75±40．88化瘀散結(jié)藥物含藥血清組 2 453．34±42．74*

表9 兩組PC-3細(xì)胞遷移距離Tab.9 Migration distance of PC-3 cells of the two groups μm

表10 PC-3細(xì)胞遷移距離比較（±s）Tab.10 Comparison of migration distance of PC-3 cells of each group（±s） μm

表10 PC-3細(xì)胞遷移距離比較（±s）Tab.10 Comparison of migration distance of PC-3 cells of each group（±s） μm

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．01。

組別 n 遷移距離對(duì)照組 2 525．40± 6．58化瘀散結(jié)藥物含藥血清組 2 330．12±13．15*

圖5 兩組DU-145細(xì)胞不同孔劃痕圖Fig.5 Illustration the different scratches of DU-145 cells of two group

圖6 兩組PC-3細(xì)胞不同孔劃痕圖Fig.6 Illustration the different scratches of PC-3 cells of two group

3.4 Real-Time PCR檢測前列腺癌細(xì)胞樣本中目的基因表達(dá)量的變化 研究結(jié)果顯示不同劑量組的前列腺活化間質(zhì)細(xì)胞系CAF中的SDF-1基因在低劑量組中表達(dá)較低，隨濃度增加其表達(dá)量亦逐漸增加。見圖7、表11。

3.5 Western Bolt法檢測CAF細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、MMP、纖維粘連蛋白（FN）蛋白表達(dá)的影響 研究結(jié)果顯示經(jīng)化瘀散結(jié)藥物作用CAF細(xì)胞后，SDF-1、IGF、MMP蛋白表達(dá)與陰性對(duì)照組相比顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見圖 8。

4 討論

近20年來，中醫(yī)藥治療前列腺癌已經(jīng)引起了廣泛的重視，臨床研究也在不斷地進(jìn)行[15]。中醫(yī)藥在增效減毒、提高生活質(zhì)量、延長生存時(shí)間等方面的獨(dú)特優(yōu)勢，使得在CRPC治療中占據(jù)了非常重要的位置[16]。

圖8 化瘀散結(jié)組藥物對(duì)SDF-1、IGF、MMP、FN蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of protein expression in SDF-1，IGF，MMP and FN by the drugs of Huayu Sanjie group

中醫(yī)藥注重辨證論治，謹(jǐn)守病機(jī)，抓住病理產(chǎn)物，對(duì)腫瘤的治療主要從扶正固本、培補(bǔ)正氣、化瘀解毒、祛痰散結(jié)、攻補(bǔ)兼施、虛實(shí)兼顧等方面入手[17]。賈英杰教授提出本元虛衰是癌病之根，邪濁（濁毒、瘀濁）內(nèi)生，久蘊(yùn)不解，發(fā)為腫塊，膠結(jié)難化，克伐臟腑經(jīng)絡(luò)，阻礙氣機(jī)升降，影響氣血運(yùn)行，形成濁邪瘀塞局部為腫瘤之核心病機(jī)。賈教授基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出前列腺癌病機(jī)為脾虛濁困、氣虛毒瘀，瘀、毒與濁邪膠著和合，發(fā)為濁毒、瘀濁，共同致病。因此，“濁”是形成前列腺癌的核心病機(jī)要素。“黜濁”辨治的核心總不離脾胃，脾胃位居中州，納運(yùn)相合，升降相因，互為舟楫，治濁需重視脾胃升降功能，燮理中焦，斡旋氣機(jī)，兼顧肝腎，使得升降有序，化生精微，充養(yǎng)五臟，使?jié)嵝暗没?，即“治脾胃者即可以安五臟”[18]。

在健脾利濕化瘀方治療脾虛瘀濁互結(jié)證晚期CRPC患者取得較好臨床療效的基礎(chǔ)上，本團(tuán)隊(duì)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)復(fù)方及其各拆方組均具有一定的抑瘤作用。為進(jìn)一步從細(xì)胞和分子通路上對(duì)復(fù)方的作用機(jī)制進(jìn)行明確，本研究首先分析健脾扶正組、化瘀散結(jié)組、清熱解毒組對(duì)前列腺癌PC-3和DU-145細(xì)胞的增殖抑制率，并篩選出抑瘤最佳的化瘀散結(jié)組，從拆方對(duì)前列腺癌PC-3和DU-145細(xì)胞的侵襲和遷移研究進(jìn)一步證實(shí)大黃、姜黃、王不留行的抑瘤作用。并通過研究證實(shí)大黃、姜黃、王不留行藥物對(duì)前列腺癌CAF細(xì)胞系IGF/MMP通路相關(guān)的IGF-1、MMP、FN、SDF-1基因的相對(duì)表達(dá)量影響均有所不同。其中，IGF-1是一種促有絲分裂劑，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用，國內(nèi)外學(xué)者越來越關(guān)注其與前列腺癌的關(guān)系；IGF-1表達(dá)的升高，與前列腺癌的細(xì)胞增殖相關(guān)，而在本研究中化瘀散結(jié)藥物具有降低IGF-1表達(dá)的作用，并呈劑量相關(guān)性。MMP家族在腫瘤的血管新生、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成等過程中扮演著重要的角色。研究結(jié)果顯示化瘀散結(jié)組藥物含藥血清作用后的前列腺間質(zhì)細(xì)胞分泌的SDF-1、IGF、MMP與上皮細(xì)胞增殖存活相關(guān)的活性因子表達(dá)情況下降。本研究探討了復(fù)方健脾利濕化瘀方整體臨床療效的作用機(jī)制，從一個(gè)方面進(jìn)行闡述，也為進(jìn)一步的深入研究提供基礎(chǔ)。