雋加香 王倩 陳輝 張津京 宋曉霞 肖婷婷 陳明杰 黃建春

摘要? ? 本試驗采集了雙孢蘑菇工廠制備的二次發(fā)酵料，通過配制不同類型的選擇培養(yǎng)基，采用涂布分離的方法，于溫度為55 ℃、濕度為60%～70%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從二次發(fā)酵料浸出液中得到高溫菌單菌落，再進行純化，然后提取純化后的高溫菌基因組DNA，采用NCBI物種相似度比對進行鑒定。結(jié)果表明，在馬丁氏培養(yǎng)基上得到棕黑腐質(zhì)霉（Humicola fuscoatra）和短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis），相似度對比均達到99.4%以上。

關(guān)鍵詞? ? 雙孢蘑菇;二次發(fā)酵料;高溫菌

中圖分類號? ? S646.11? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）06-0076-01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

隨著人們生活水平的提高，市場對于食用菌的需求越來越大，生產(chǎn)食用菌需要制備大量培養(yǎng)料，制備良好的培養(yǎng)料中含有大量的有益微生物，其中有些重要微生物必須在培養(yǎng)料的發(fā)酵過程中才能正常生長，有些重要微生物可以在分離純化后人工培養(yǎng)。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus（J.E.Lange）Imbach.）又稱白蘑菇，是世界栽培面積最廣的食用菌，占全球食用菌產(chǎn)量的38%。雙孢蘑菇培養(yǎng)料腐熟過程中各類高溫菌大量繁殖，如嗜熱性細菌、嗜熱性放線菌、嗜熱性霉菌，參與一次發(fā)酵與二次發(fā)酵中的各種生理生化過程，與有害微生物存在競爭關(guān)系，對發(fā)酵料的pH值、EC值、碳氮比、營養(yǎng)物質(zhì)含量等有密切的影響，最終影響到培養(yǎng)料的質(zhì)量與雙孢蘑菇的產(chǎn)量。倘若能從培養(yǎng)料中分離提取并鑒定出小部分起重要作用的嗜熱性微生物，可以加深對發(fā)酵料腐熟的機理與過程的認識，可以為培養(yǎng)料制備過程提供指導(dǎo)，也有利于培養(yǎng)料微生物添加劑的開發(fā)。一般此類嗜熱性微生物最適宜的溫度范圍為45～55 ℃，最高溫度范圍為60～90 ℃，最低溫度范圍為25～45 ℃，而嗜溫性微生物與嗜冷性微生物的最高溫度范圍分別為30 ℃和43 ℃。本試驗以55℃作為篩選培養(yǎng)的溫度，能夠保證篩選分離出的微生物均為嗜熱性微生物。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

從上海聯(lián)中食用菌的雙孢蘑菇二次發(fā)酵料料倉中部采集出的表面有明顯白色放線菌的出倉二次料，用無菌自封袋封裝。

馬丁氏培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂20.0 g，孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL;121 ℃，30 min滅菌;用于分離培養(yǎng)絲狀真菌。

1.2? ? 高溫菌提取與純化

1.2.1? ? 出倉二次發(fā)酵料的活化。將用無菌自封袋封裝的二次發(fā)酵料置于55 ℃、濕度約為60%的恒溫培養(yǎng)箱中活化12 h。

1.2.2? ? 篩選分離與純化。取5～10 g二次發(fā)酵料浸沒于無菌水中，振蕩10 min，吸取一定量的二次料浸出液，將浸出液稀釋出10倍、100倍、1 000倍、10 000倍、100 000倍、1 000 000倍6個濃度梯度，將6個濃度的菌液分別涂布于上述各類培養(yǎng)基上。

將已涂布有菌液的各類培養(yǎng)基倒置于55 ℃、濕度為60%～70%的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)12 h，即可肉眼看見不同的單菌落;待圓形菌落半徑擴大至1 cm左右時，用接種針挑取各菌落外圍的微生物接種至同類培養(yǎng)基中進行純化培養(yǎng)，純化操作的次數(shù)取決于純化程度。

將雙孢蘑菇二次料浸出液稀釋后直接涂布在馬丁氏培養(yǎng)基上，篩選出重要微生物的概率較小，因而使用這種培養(yǎng)基時，在方法上要做一定改良。改良方法如下：用鑷子夾取2 cm左右的二次料秸稈接種在培養(yǎng)基上，倒置于55 ℃、濕度約為70%的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)1 d，即可發(fā)現(xiàn)有菌類在培養(yǎng)基上生長，菌落半徑擴大至1 cm左右時，用接種針挑取菌落外圍的微生物接種至同類培養(yǎng)基中進行純化培養(yǎng)。

1.3? ? 鑒定

參照上海桑尼生物科技有限公司物種鑒定方法[1]。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 純化菌種在不同培養(yǎng)基上的生長情況

涂布有菌液的馬丁氏培養(yǎng)基倒置于55 ℃、濕度60%恒溫培養(yǎng)箱中，12 h后肉眼可看見生長的菌落，并繼續(xù)進行純化培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，該菌落生長緩慢，60 h左右可完成純化過程，長出白色毛狀和深色圓形菌落。浸出液稀釋濃度梯度對比發(fā)現(xiàn)，稀釋10倍的浸出液可優(yōu)先得到菌落（圖1）。

2.2? ? 純化菌種的鑒定

將馬丁氏培養(yǎng)基上生長純化后的菌落提取高溫菌基因組DNA，采用NCBI物種相似度比對進行鑒定。得到短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）、棕黑腐質(zhì)霉（Humicola fuscoatra），相似度對比分別為99.49%、99.46%。

3? ? 結(jié)論與討論

雙孢蘑菇二次培養(yǎng)料主要由木質(zhì)纖維素成分和嗜熱微生物組成，微生物菌群和雙孢蘑菇菌絲體共同降解利用培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素成分，對蘑菇產(chǎn)量和品質(zhì)起到了關(guān)鍵性作用[2-3]。對嗜熱微生物菌落的種類和特征進行研究有助于制作出培養(yǎng)料微生物菌劑或生物表面活性劑，從而改善微生物群落，提高堆肥培養(yǎng)料中纖維素的分解程度，有利于菌絲更好地吸收和利用，達到刺激蘑菇生長或增產(chǎn)的效果，進一步提高雙孢蘑菇工廠化周年生產(chǎn)的效益。

本研究從馬丁氏培養(yǎng)基平板上得到了嗜熱真菌短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）和棕黑腐質(zhì)霉（Humicola fusc-oatra）單菌落，相似度對比均達99.4%以上。首先，嗜熱真菌產(chǎn)生的嗜熱酶具有很強的纖維素降解能力，能降解細菌菌體;其次，嗜熱真菌在繁殖過程中分泌次級代謝產(chǎn)物，如腐質(zhì)霉菌會分泌V■，可作為蘑菇菌絲的營養(yǎng)素來源[4]。Wiegant[5]發(fā)現(xiàn)，嗜熱真菌可以刺激蘑菇菌絲萌發(fā)與生長，促進菌絲吃料，從而減少其他雜菌污染，相應(yīng)地提高了蘑菇產(chǎn)量。

如上所述，嗜熱真菌的存在對雙孢蘑菇二次培養(yǎng)料發(fā)酵的好壞起了決定性作用，可以將這些有益微生物提取出來作為菌劑或生物表面活性劑添加到培養(yǎng)料中來提高蘑菇品質(zhì)和產(chǎn)量[6]。本研究除了提取出通常報道的嗜熱真菌棕黑腐質(zhì)霉（Humicola fuscoatra）外，還發(fā)現(xiàn)了一些不熟悉的嗜熱微生物短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）等新成員，極大地拓寬了人們對雙孢蘑菇二次發(fā)酵堆肥這一復(fù)雜生境中微生物的認識，也啟發(fā)了人們要善于利用分子生物學(xué)技術(shù)來獲得一些尚未培養(yǎng)出的微生物類群。

4? ? 參考文獻

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[2] JURAK E，KABEL M A，GRUPPEN H.Carbohydrates composition of compost during composting and mycelium growth of Agaricus bisporus[J].Carbohydrate，2014，101：281-288.

[3] 高曉靜，張昊琳，佟佳興，等.不同配方雙孢蘑菇培養(yǎng)料的細菌群落結(jié)構(gòu)和理化性狀[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2017，23（3）：502-510.

[4] 杜愛玲，陳立國，楊新美.雙孢蘑菇培養(yǎng)料微生物研究概況[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（2）：51-53.

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[6] 李云福，李正風(fēng)，董高峰，等.雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程中細菌群落動態(tài)變化[J].菌物研究，2019（2）：94-102.