潘珍 程冬冬 位曉娟 李世杰 郭華 楊慶誠

骨肉瘤是常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤。骨肉瘤好發(fā)于長骨干骺端，是導(dǎo)致兒童和青少年癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1-2]。目前，骨肉瘤治療方案主要為原發(fā)腫瘤切除聯(lián)合術(shù)前及術(shù)后的化學(xué)治療，這使骨肉瘤患者5年生存率提高至60%～70%[3-4]。然而，仍有約50%的骨肉瘤患者在治療過程中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中近90%為肺轉(zhuǎn)移[5]?；颊咭坏┏霈F(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，其5年生存率則降至11%～29%[6]。雖然骨肉瘤治療的新方案層出不窮，但由于存在早期肺轉(zhuǎn)移，以及部分患者對化療不敏感，骨肉瘤患者的致死率和致殘率仍然較高[7]。

殼寡糖是甲殼質(zhì)或殼聚糖部分降解的產(chǎn)物，其分子量小，易溶于水，無細(xì)胞毒性，與殼聚糖相比具有更好的生物活性[8]。殼寡糖通常為含2～10個氨基葡萄糖的不同聚合度的物質(zhì)[9]。殼聚糖酶能水解殼寡糖，使其從較高聚合度轉(zhuǎn)為低聚合度，在其水解期間進(jìn)行不斷純化，可得到以單糖為主的最終水解產(chǎn)物[10-11]。已有研究表明，不同聚合度的殼寡糖發(fā)揮不同的生物效應(yīng)，高聚合度殼寡糖(五聚體和六聚體)可顯示出更高的抗腫瘤增殖活性[12-13]。近年，殼寡糖在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用已引起學(xué)者們關(guān)注[14-15]。然而，殼寡糖尤其是單糖，對骨肉瘤細(xì)胞影響的研究報(bào)道較少。同時，其抗腫瘤作用的機(jī)制也尚不明確。本研究擬初步探索殼五糖對骨肉瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用，以及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株：人骨肉瘤細(xì)胞系MNNG、MG63、U2OS(均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

主要試劑和儀器：Dulbecco改良的Eagle(DMEM)培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(澳洲Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶/EDTA(美國Gibco公司)，CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Transwell小室(美國康寧公司)，Matrigel膠(美國BD Biosciences公司)，蛋白質(zhì)提取試劑(美國Thermo Fisher公司)，蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，PVDF膜(美國Millipore公司)，抗體：磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、凋亡相關(guān)半胱氨酸蛋白酶(CASP)9、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)6、 β-Actin(美國Proteintech Group公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo HERAcell 150，美國Thermo Fisher公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞MNNG、MG63，RPMI 1640 培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞 U2OS。所有培養(yǎng)基中均加入 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，于37 ℃， 二氧化碳(CO2)體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活性及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取骨肉瘤細(xì)胞以每孔5 000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，采用不同質(zhì)量濃度的殼寡糖單糖(殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖)處理3種骨肉瘤細(xì)胞，其中MNNG細(xì)胞設(shè)置的質(zhì)量濃度梯度為0 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL，MG63細(xì)胞為0 mg/mL、0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL，U2OS細(xì)胞為0 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL。處理48 h后去除培養(yǎng)液，每孔加入DMEM 100 uL 和CCK-8溶液10 uL，37 ℃敷育2 h。使用酶標(biāo)儀檢測每孔吸光度(OD450)，計(jì)算不同殼寡糖單糖的半數(shù)抑制濃度(IC50)。為了檢測細(xì)胞增殖情況，將細(xì)胞接種到96孔板(5 000個細(xì)胞/孔)，然后使用質(zhì)量濃度為IC50的殼寡糖單糖(殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖)處理細(xì)胞5 d，每天采用CCK-8法測定細(xì)胞活性。

1.4 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

先用殼五糖處理細(xì)胞48 h后，將1×103個細(xì)胞接種于6孔板中，并在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10～14 d后，將細(xì)胞用100%甲醇固定30 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，最后計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

1.5 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室中將含有5×104個細(xì)胞的200 uL無血清培養(yǎng)基直接滴入上室為細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定時，則需將1×105個細(xì)胞放置于上室中，其上涂有用無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel(1∶7稀釋)，并保持上室培養(yǎng)基中含有質(zhì)量濃度為IC50的殼五糖。分別將800 uL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到下室中。在37 ℃下孵育后，將膜底表面的細(xì)胞用100%甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞凋亡檢測：將細(xì)胞接種在6孔板中，每孔3×105個細(xì)胞，然后用質(zhì)量濃度為IC50的殼五糖處理細(xì)胞。48 h后，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明收集細(xì)胞，洗滌并染色，在流式細(xì)胞儀上讀取樣品。

細(xì)胞周期測定：按上述方法處理細(xì)胞，然后使用細(xì)胞周期和凋亡分析試劑盒進(jìn)行收集并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測實(shí)驗(yàn)

用質(zhì)量濃度為IC50的殼五糖處理3種骨肉瘤細(xì)胞48 h后，使用蛋白質(zhì)提取試劑、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑組成的混合物提取細(xì)胞蛋白，通過BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒進(jìn)行測量。將蛋白質(zhì)裂解物分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂乳封閉，用一抗于4 ℃孵育過夜，PBS液洗膜3次，每次15 min；用二抗室溫孵育2 h，然后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液檢測反應(yīng)蛋白條帶，并使用Bio-Rad ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)獲得可視化圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過t檢驗(yàn)評估兩組之間的差異，圖形使用GraphPad Prism 8軟件生成。計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖單糖對骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用

CCK-8法檢測不同聚合度殼寡糖單糖對骨肉瘤細(xì)胞系體外活力的影響發(fā)現(xiàn)，殼寡糖單糖對骨肉瘤細(xì)胞系的抑制作用呈劑量依賴性，見圖1。3種骨肉瘤細(xì)胞系中不同殼寡糖單糖的IC50值見表1，5種殼寡糖單糖對骨肉瘤細(xì)胞均有抑制作用，其中殼五糖的抑制作用稍高。

圖1 殼寡糖單糖對骨肉瘤細(xì)胞活力的影響

表1 不同殼寡糖單糖在3種骨肉瘤細(xì)胞中的IC50/mg·mL-1

2.2 殼五糖對骨肉瘤細(xì)胞增殖和克隆形成能力的抑制作用

通過對不同殼寡糖單糖對骨肉瘤細(xì)胞系IC50的比較，選擇殼五糖進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，殼五糖的質(zhì)量濃度為其對3種骨肉瘤細(xì)胞的IC50(MNNG 1.55 mg/mL、MG63 0.84 mg/mL、U2OS 0.76 mg/mL)，驗(yàn)證其對骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組(等體積PBS)相比較，質(zhì)量濃度為IC50的殼五糖處理骨肉瘤細(xì)胞可明顯抑制其增殖能力(圖2a)。同樣，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，殼五糖明顯減少骨肉瘤細(xì)胞集落的形成(圖2b、圖2c)。

圖2殼五糖對骨肉瘤細(xì)胞增殖和克隆形成的影響 殼五糖抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖(a)和細(xì)胞集落形成(b、c)，*為兩組比較P<0.05 **為兩組比較P<0.01

2.3 殼五糖抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力

細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)均表明，殼五糖處理骨肉瘤細(xì)胞系后，穿透Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。該結(jié)果提示，殼五糖顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖3殼五糖對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 殼五糖抑制細(xì)胞的遷移和侵襲(×200)(a)，*為兩組比較P<0.05 **為兩組比較P<0.01

2.4 殼五糖對骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示殼五糖可抑制骨肉瘤細(xì)胞由S期向G2期轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程；另外，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，殼五糖組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，見下頁圖4。以上結(jié)果表明殼五糖處理骨肉瘤細(xì)胞后阻礙了細(xì)胞周期的進(jìn)展并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.5 殼五糖對PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

利用蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵因子，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可見，與對照組相比，殼五糖組的p-PI3K、p-AKT、CDK6的蛋白表達(dá)水平明顯下降，CASP9表達(dá)明顯增加，而PI3K、AKT的蛋白表達(dá)水平無明顯變化(下頁圖5)。

3 討論

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性骨腫瘤[16-17]，好發(fā)于長骨干骺端[18]。盡管化療方案不斷改進(jìn)，但其復(fù)發(fā)率仍然很高[19]。腫瘤轉(zhuǎn)移依然是骨肉瘤患者死亡的主要原因，且對于肺轉(zhuǎn)移患者，目前的治療方法還是依賴于手術(shù)切除和全身化療[20]。隨著對骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的認(rèn)識不斷深入，探索調(diào)控骨肉瘤發(fā)生及其轉(zhuǎn)移侵襲的機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究骨肉瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號靶點(diǎn)，并對此進(jìn)行針對性干預(yù)，確定更有效的治療方案，將有望改善骨肉瘤的臨床療效及預(yù)后。

圖4殼五糖對骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響 抑制骨肉瘤細(xì)胞由S期向G2期轉(zhuǎn)變(a、b)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡(c、d), *為兩組比較P<0.05 **為兩組比較P<0.01

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子表達(dá) *為兩組比較P<0.05 **為兩組比較P<0.01

目前，越來越多的學(xué)者關(guān)注到海洋生物在腫瘤治療中的應(yīng)用。殼聚糖來源于甲殼素的脫乙酰作用，它是貝殼類骨骼和真菌細(xì)胞壁的主要成分[21]。殼聚糖通過殼聚糖酶水解或化學(xué)方法可制得聚合度小于20且平均相對分子質(zhì)量<3 200的殼寡糖[22]。目前，殼寡糖已被證明具有多種生理活性，如抗菌，抗病毒，抗腫瘤，抗氧化，免疫調(diào)節(jié)等[23-24]。有文獻(xiàn)報(bào)道，完全乙?；屯耆撘阴；臍ち蔷哂锌鼓[瘤活性，且高聚合度殼寡糖(五聚體和六聚體)顯示出更高的抗腫瘤活性[13]。因此，殼寡糖，尤其是其單糖形式可能成為治療腫瘤的新型化合物。

本研究的目的在于探索殼寡糖單糖殼五糖是否具有抗骨肉瘤細(xì)胞活性的能力及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，殼寡糖單糖能夠以劑量依賴性方式抑制骨肉瘤細(xì)胞生長，其中以殼五糖作用效果最佳。同時發(fā)現(xiàn)，殼五糖不僅抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力，也抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另外，殼五糖可通過抑制細(xì)胞周期從S期向G2期的轉(zhuǎn)變來延遲細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖可增強(qiáng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2家族基因效應(yīng)蛋白(Bak)表達(dá)并減少Bcl-2蛋白和Bcl-xL蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[25]。而在人肝細(xì)胞癌中，殼寡糖能通過提高CASP3的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，殼五糖作用于3種骨肉瘤細(xì)胞(MNNG、MG63、U2OS)可使其p-PI3K、p-AKT、CDK6的蛋白表達(dá)明顯下降，CASP9表達(dá)明顯增加，提示殼五糖可能通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，我們得出結(jié)論，殼五糖可在體外試驗(yàn)中有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié) PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生的。

骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展是涉及多階段、多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程，本研究僅初步探討了殼五糖對骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用，但對殼五糖是否能應(yīng)用于骨肉瘤治療及其對PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。