岳 明 ，陳正行 ，徐鵬程 ，王 濤 ，李亞男 ，王 韌 *

（1. 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

大米蛋白的氨基酸配比合理，營養(yǎng)價值優(yōu)于其他谷物類蛋白[1]。但是，較差的水溶性嚴重限制了其大米蛋白的應用范圍。 在食品體系中，大米蛋白常作為固體營養(yǎng)物添加于運動類食品中，或作為低敏性食物添加到嬰幼兒食品中[2]。 徐興鳳[3]等人通過生物酶解改性大米谷蛋白，陸鈁[4]等人采用化學糖基化改善大米蛋白功能特性，此類方法在一定程度上提高了大米蛋白的水溶性[5，6]，但不可避免的是，改性過程造成營養(yǎng)物質(zhì)流失，或者化學物質(zhì)的引入。 近年來，國內(nèi)不斷有進行改善大米蛋白溶解度的研究，但在如何提高大米蛋白溶解度的同時又保持其獨特的營養(yǎng)特性卻鮮有報道。

大米蛋白具有良好的乳化性、起泡性以及凝膠性等特性。 其中，蛋白乳化特性在食品體系中起到穩(wěn)定體系、促進分散相形成等作用。 食品中常見的納米乳液有油包水（W/O）和水包油（O/W）兩種，為了避免乳液出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集、油滴絮凝、貯藏穩(wěn)定性較差等問題[7，8]，相關研究主要采用在乳化過程中加入多糖、凝膠等乳化劑的方法，增強蛋白質(zhì)乳化性和乳液穩(wěn)定性[9]，但乳化劑的引入限制了乳液在食品體系的應用。 目前，國內(nèi)針對自乳化的研究多面向于藥物運載的應用[10，11]，而在食品體系中研究大米蛋白自乳化行為的報道更是空白。 作者以大米蛋白為原料，通過結(jié)合酪蛋白改善其溶解度并進行水相與油相丁香酚自乳化，探究乳液對丁香酚的控釋效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米：中糧食品營銷有限公司提供；丁香酚，8-苯胺-1-萘磺酸（ANS），考馬斯亮藍 R-250：購自1Sigma-Aldrich 公司； 酪蛋白，十二烷基硫酸鈉（SDS），氯化鈉等其他試劑：分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

POLY 15 磁力攪拌器，美國 Thermo Scientific公司產(chǎn)品；D-37520 Osterode 小型高速離心機：德國Sigma zentrifugen 公司產(chǎn)品； 等溫滴定量熱儀（PEAQ-ITC）：英國 Malvern Instrument；納米粒度及ZETA 電位儀 （Zetasizer nano ZS）：英國 Malvern Instrument 公司產(chǎn)品；F-7000 熒光光譜儀：日本Hitachi 公司產(chǎn)品；全自動表面張力儀（DCAT21）：德國Dataphysics 公司產(chǎn)品；UV-3200 紫外-可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司產(chǎn)品；原子力顯微鏡（Dimension ICON）：德國 Bruker 公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米蛋白-酪蛋白共架體的制備 將大米蛋白分散于去離子水中形成1 g/dL 的蛋白質(zhì)分散液，用4.0 mol/L NaOH 將樣品調(diào)至pH 12.0 并攪拌1 h。加入相同質(zhì)量的酪蛋白持續(xù)攪拌1 h 后，逐滴加入0.05 mol/L HCl，調(diào)節(jié)樣品 pH 至 7.0。 在 4 ℃，7 000 g下離心樣品10 min，上清液用MD 45 透析袋在去離子水中透析12 h，去除溶液中的鹽分，隨后將樣品進行冷凍干燥。

1.2.2 凝膠電泳實驗 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定采用 Laemmli 法[12]。 配置 pH 為 6.8，含 0.125 mol/L Tris-HCl、質(zhì)量分數(shù)10% SDS、20%甘油以及體積分數(shù)2%的巰基乙醇（2-ME）的上樣緩沖溶液。 取5 mg/mL 得樣品和標準蛋白質(zhì)分別溶解于其中，95 ℃下加熱 5 min，冷卻，10 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心30 s。 在電泳凝膠中加入 10 μL 上清液，100 V 恒壓下分離1 h。 分離結(jié)束后將電泳凝膠放入考馬斯亮藍染色液質(zhì)量分數(shù) 0.05%，（v（甲醇）∶v（乙酸）∶v（水）=25∶10∶65）中著色，隨后在 v（甲酸）∶v（乙醇）∶v（水）=1∶1∶8 的脫色液中脫色 24 h。

1.2.3 溶解度的測定 蛋白質(zhì)溶解度的測定采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2010）。

1.2.4 表面疏水性的測定 采用ANS 熒光探針法測定蛋白質(zhì)表面疏水性[13]。取0.1 g 樣品分散于10 mL pH=7 的磷酸鹽緩沖溶液中（10 mmol/L），將樣品溶液分別稀釋成質(zhì)量分數(shù)0.001 5%、0.003%、0.006%、0.012%以及0.015%5 個濃度梯度。取10 μL 新鮮配置的 ANS 溶液（8 mmol/L）置于 4 mL 稀釋后的樣品中，振蕩混勻。 在激發(fā)波長390 nm 和發(fā)射波長484 nm 下，測定樣品熒光強度。 以測定的熒光強度與相應蛋白質(zhì)濃度作圖后進行線性擬合，將所作線性回歸曲線的斜率作為蛋白質(zhì)表面疏水性。

1.2.5 表面張力測定 采用有Du Noüy 探針環(huán)的全自動表面張力儀進行油水表面張力的測定。 取25 mL 丁香酚與等體積的去離子水或共架體蛋白溶液置于 100 mL 燒杯中，將 Du Noüy 探針環(huán)浸沒在密度較大的一相，通過表面張力儀自動調(diào)節(jié)，將探針環(huán)調(diào)節(jié)到靠近兩相界面的位置，以恒定速度使探針環(huán)拉過界面，同時測定在此過程中探針環(huán)上作用力的變化。 將探針環(huán)在拉過相界面過程中的最大作用力作為兩相的界面張力γ。

1.2.6 等溫滴定量熱實驗 等溫滴定量熱法（Isothermal titration calorimetry，ITC）：配質(zhì)量分數(shù)為0.1%的大米蛋白質(zhì)和2 mg/mL 丁香酚水溶液，過膜后高速離心去除氣泡。 通過PEAQ-ITC 等溫滴定量熱儀分析25 ℃條件下樣品的反應模式。 將樣品預先脫氣，取 400 μL 蛋白液于樣品池，50 μL 丁香酚水溶液于注射器。 樣品針轉(zhuǎn)速為350 r/min，待儀器平衡后，向樣品池滴入丁香酚水溶液，程序設定為每8 s 滴入3 μL 丁香酚并平衡反應150 s。 以超純水與蛋白液的反應過程為對照。

1.2.7 自乳化實驗及乳液成分測定 自乳化實驗，取7 份0.01 g 共架體蛋白分別溶于10 mL 去離子水（質(zhì)量分數(shù) 0.1%），并分別加入 5、10、30、50、100、200、300 μL 丁香酚，置于 POLY 15 磁力攪拌器以600 r/min 轉(zhuǎn)速乳化 1 h，分別作為 A、B、C、D、E、F、G共7 種乳液后續(xù)實驗原料。

乳液成分分析實驗，取上述乳液各1 mL，用乙醇稀釋10 000 倍，用紫外-可見分光光度計在281 nm 下測定相應吸光值，通過吸光值與丁香酚質(zhì)量分數(shù)的標準曲線，計算丁香酚質(zhì)量分數(shù)。 乳液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的測定將采用1.2.3 中凱氏定氮法。

1.2.8 乳液的粒徑分布、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI） 及 Zeta-電位的測定 將 1.2.7 所制備的乳液用去離子水稀釋100 倍后，取1mL 樣品放入Zeta-電位比色皿中用納米粒度及Zeta-電位儀在室溫條件下分別對乳液的粒徑分布、Zeta-電位及多分散系數(shù)進行測定。

1.2.9 貯藏實驗 將制備的乳液放置于25 ℃恒溫箱貯藏28 d，以7 d 為一周期，取樣稀釋100 倍進行粒徑分布和Zeta-電位的測定。

1.2.10 丁香酚控釋實驗 取10 mL 乳液于MD44型號透析袋中，放置于5 000 mL 去離子水透析8 h。不同時間段取樣，采用方法1.2.6 測定丁香酚釋放量，以飽和丁香酚水溶液為對照。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果均取3 次平行結(jié)果平均值，采用 origin 8.9 作圖，SPSS 21.0 進行 ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米蛋白/酪蛋白共架體蛋白質(zhì)的表征

2.1.1 復合體蛋白一級結(jié)構(gòu)的測定 通過凝膠電泳分析蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，對比復合體蛋白與原蛋白一級結(jié)構(gòu)差異。 由圖1 所示，大米蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布于 2.5×105、2.5×104～3.7×104以及1 000～2 000 范圍內(nèi)，酪蛋白的主要相對分子質(zhì)量分布在 2.5×104～3.7×104區(qū)域內(nèi)，復合體蛋白相對分子質(zhì)量分別在 2.5×105、2.5×104～3.7×104以及 1 000～2 000 內(nèi)，且 2.5×104～3.7×104內(nèi)的條帶變粗顏色加深，表明該范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)亞基含量增多。 通過對比可得，溶于去離子水的復合體蛋白未發(fā)生水解并保持了大米蛋白和酪蛋白良好的一級結(jié)構(gòu)，與Wang[14]等人研究結(jié)果一致。

圖1 凝膠電泳圖像Fig. 1 Gel electrophoresis image

2.1.2 共架體蛋白溶解度測定 由表1 所示，未經(jīng)處理的大米蛋白在水中的溶解度僅為1.65%，這與崔莎莎[15]等研究結(jié)果一致。經(jīng)與酪蛋白復配處理后，大米-酪蛋白共架體的溶解度顯著提高至91.01%，說明酪蛋白與大米蛋白結(jié)合促進了大米蛋白在水中的溶解性。 鑒于酪蛋白在復配過程中添加量，大米蛋白溶解度的提高幅度至少為49 倍，具有極顯著的改性效果，說明本研究所采用的改性方法是一種高效、綠色的物理改性手段。

2.1.3 共架體蛋白疏水性表征 從圖2 可知，大米蛋白表面疏水性過高導致大米蛋白難溶于水[16]，與酪蛋白結(jié)合后，共架體蛋白表面疏水性顯著降低，是由于大米蛋白與酪蛋白結(jié)合過程中三級結(jié)構(gòu)展開，并發(fā)生一系列的結(jié)構(gòu)折疊變化，從而將大量疏水基埋藏在蛋白體內(nèi)部，表明酪蛋白與大米蛋白之間通過疏水作用結(jié)合[17]。

圖2 3 種蛋白質(zhì)表面疏水力對比Fig. 2 Contrast surface hydrophobic of the three type proteins

2.2 共架體蛋白的自乳化行為研究

2.2.1 共架體蛋白自乳化的形成 油水兩相發(fā)生自乳化行為所必須的兩個條件為：1）具有較低的表面張力；2）乳化劑在界面形成結(jié)構(gòu)韌性高且流動性強的界面膜。 當同時具備這兩個條件時，較低的能量輸入能夠引起不溶相快速乳化，形成平均粒徑較小的乳液[18]。 圖3 比較了在界面拉伸過程中，Du Noüy 上作用力變化。 從中可知，丁香酚與水之間的界面張力γ 高達9.0 mN/m，而共架體蛋白使γ 降低至2.8 mN/m。 此外，共架體蛋白延緩了兩相之間界面崩塌的發(fā)生，表明共架體蛋白在油水界面形成彈性加高、而結(jié)構(gòu)韌性較強的界面膜，為自乳化的發(fā)生提供所需的結(jié)構(gòu)條件。 因此，有必要對共架蛋白與丁香酚的作用進行進一步表征。

圖3 界面拉伸過程中Du Noüy 上作用力的變化Fig. 3 Variation of force during the Du Noüy stretching interface

2.2.2 共架體蛋白與丁香酚的相互作用 通過蛋白質(zhì)構(gòu)象變化前后數(shù)據(jù)對比，ITC 能夠測定蛋白質(zhì)-配基間熱力學變化[19]。 共架體與丁香酚反應過程中熱量變化如圖4 所示，通過對此程熱量變化相對配體-配基摩爾比作圖，并采用Independent 模型擬合得出配體-配基反應的熱力學參數(shù)。 共架體蛋白與丁香酚的結(jié)合過程中，ΔG＜0，ΔS＜0，表明反應為自發(fā)放熱過程，同時ΔS＞ΔH，表明此過程為熵驅(qū)動[14]。通過對此反應過程進一步分析，發(fā)現(xiàn)首滴丁香酚（2 μL）與共架蛋白體反應信號峰最強，表明反應過程放熱量大，反應最劇烈。 當?shù)稳氲谌味∠惴雍螅S著丁香酚含量的增加放熱峰減弱趨勢變緩，表明在滴入第三滴配體后蛋白質(zhì)-丁香酚之間反應達到飽和。 以上結(jié)果表明，共架蛋白能夠與丁香酚產(chǎn)生劇烈的作用，這是共架蛋白能夠自發(fā)乳化丁香酚的重要因素。

圖4 丁香酚滴定共架蛋白質(zhì)放熱過程Fig. 4 Exothermic process of eugenol titration coprotein

2.3 乳液特性分析

2.3.1 乳液成分分析 從表1 可得，隨著丁香酚添加量的增加丁香酚的裝載效率下降，質(zhì)量分數(shù)0.1%共架體蛋白溶液形成的乳液對丁香酚的最大裝載量達28.52 μL/L，該值遠高于丁香酚在水中的溶解量（3.3 μL/L）。乳液中蛋白質(zhì)利用率高達76%以上，共架體蛋白質(zhì)對丁香酚的結(jié)合量最高可達0.34 mL/g，表明共架體蛋白與丁香酚的自乳化方法高效、可行。

表1 蛋白質(zhì)利用率、丁香酚裝載效率及蛋白質(zhì)與丁香酚的結(jié)合量Table 1 Utilization of CPS and efficiency of encapsulating eugenol and the binding capacities between CPS and eugenol

2.3.2 改變丁香酚含量對乳液特性的影響 由圖5可得（圖中樣品A～G 為共架體蛋白與丁香酚質(zhì)量體積比（g∶mL）分別以 1∶0.5、1∶1、1∶3、1∶5、1∶10、1∶20 以及1∶30 比例自乳化所得乳液，下同），不丁香酚形成的乳液平均粒徑均＜200 nm，且PDI＜0.5，表明共架體蛋白與丁香酚在自乳化過程中形成了納米級、均勻分布的納米乳，進一步證明共架體蛋白通過降低油水界面間的表面張力使乳液液滴間間的乳化層增加，形成穩(wěn)定的乳液。 其中在樣品C 中，即當共架體蛋白質(zhì)與丁香酚比例為1 g∶3 mL 時，平均粒徑最?。?02.5 nm），且 PDI 最低（0.278），表明當共架體蛋白與丁香酚以1 g∶3 mL 比例進行乳化時形成的乳液最穩(wěn)定，粒子形態(tài)分布最為均勻。 由zeta-電位表征圖可知，該乳液體系的Zeta-電位＜-30 mV，與徐興鳳等[3]酶法改性大米谷蛋白中的穩(wěn)定性較好的乳液電荷特性結(jié)果一致，由此可知乳液液滴間通過靜電排斥作用保持穩(wěn)定[20]。以上實驗表明，共架體蛋白質(zhì)與丁香酚發(fā)生分子相互作用，并在油水界面形成具有一定韌性、結(jié)構(gòu)強度的界面膜，使得丁香酚與水的界面張力大大下降，在低速攪拌的過程中能夠降低油滴粒徑并形成納米級乳液。

圖5 丁香酚平均粒徑、PDI 以及Zeta-電位的影響Fig. 5 Effects of eugenol content on average particle size、PDI and Zeta-potential

2.3.3 乳液的貯藏穩(wěn)定性 由于丁香酚自身對細菌、霉菌以及真菌具有良好的抑制作用[21]，本研究中將自乳化乳液置于25℃條件下儲藏并對其粒徑變化進行表征。 由圖6 可知，7 種乳液在貯藏28 d 后平均粒徑均＜300 nm，在貯藏28 d 后平均粒徑變化范圍在100 nm 內(nèi)。 以樣品C 為例，研究其貯藏1、14、28 d 天粒徑體積分布變化（圖 6）。 結(jié)果表明，乳液粒徑主要分布于10～100 nm 之間，隨著貯藏時間的增長粒徑分布曲線向右移，乳液中粒徑＞100 nm左右的粒子增多，但乳液液滴間仍保持著穩(wěn)定的相互作用，未見絮凝現(xiàn)象發(fā)生。當貯藏到28 d 時，乳液中出現(xiàn)少量粒徑大于1 μm 的聚集體。 在貯藏過程中由于丁香酚會從乳液中析出，導致平均粒徑出現(xiàn)略有降低的現(xiàn)象[13]。 由圖7 對比貯藏28 d Zeta-電位變化可知，貯藏期間Zeta-電位強度值均大于25 mV，進一步說明乳滴之間通過靜電相互作用維持體系穩(wěn)定，使乳液具有良好的貯藏穩(wěn)定性。 貯藏過程中乳液中丁香酚的析出減少了乳滴上的帶電荷，致使Zeta-電位強度值略有降低，但未從本質(zhì)上破壞納米乳的穩(wěn)定狀態(tài)。

圖6 25 ℃貯藏28 d 乳液儲藏平均粒徑和粒徑體積分布變化Fig.6 Variation of the average particle size and distribution of Storing emulsion during 25 ℃storage 28 days

圖 7 25 ℃貯藏28 d 乳液電位變化Fig.7 Variation of emulsion potential during 25 ℃storage 28 days

2.4 乳液中丁香酚的控釋研究

生育酚、芹菜素等生物活性小分子在人體消化過程中，由于其難溶性且穩(wěn)定性差等缺陷而難以被機體有效利用[22]。為探究共架體蛋白-丁香酚形成的乳液是否具有緩釋作用，作者對丁香酚體外釋放行為進行表征。圖8 為丁香酚的釋放曲線，采用Liu 等[23]的研究模型式（2）對其釋放過程進行描述。

式中：Q 為丁香酚在時間t 上的釋放率，%；k 為釋放速率常數(shù)

以丁香酚水溶液為對照，發(fā)現(xiàn)其在120 min 時丁香酚釋放量接近100%。 與之不同的是，在同等條件下乳液中的丁香酚釋放量均低于50%。 同時，從一級釋放動力學對數(shù)擬合曲線圖可知，隨著時間延長乳液對丁香酚的釋放速率變緩，釋放速率常數(shù)k隨著丁香酚含量的增大而增大，表明丁香酚改變了共架體蛋白結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生微孔結(jié)構(gòu)。 因而，我們可以根據(jù)這個現(xiàn)象進行乳化層結(jié)構(gòu)的可控設計，并建立具有不同結(jié)構(gòu)強度乳化層的控釋體系，并利用其不同的釋效果進行油溶性生物活性物質(zhì)的遞送與釋放研究。

圖8 乳液中丁香酚釋放動力曲線和一級釋放動力學擬合曲線Fig. 8 Release kinetics of eugenol from emulsions and the fitting data according to the first order release kinetics

3 結(jié) 語

通過大米蛋白和酪蛋白間疏水作用制備了溶解度高于90%的納米級共架體蛋白。 鑒于大米蛋白良好的疏水特性，共架體蛋白能夠與丁香酚進行疏水結(jié)合，極大地降低油-水界面間的表面張力，從而自發(fā)形成納米級乳液，其粒徑小于200 nm。 貯藏28 d后納米乳未發(fā)生明顯的顆粒聚集現(xiàn)象，說明其具有良好的貯藏特性。 乳液控釋研究結(jié)果表明，丁香酚的釋放符合一級釋放動力學模型且納米乳對丁香酚具有良好控釋作用。