周林芳 ，江 波 ，李淑華

（1． 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；3．江蘇工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南通 226007）

白藜蘆醇是一種天然多酚，是植物為防御機(jī)械損傷、真菌感染或紫外線照射等而產(chǎn)生的[1]。 目前至少有34 科、69 屬，100 種不同的植物可產(chǎn)生白藜蘆醇[2]。 雖然國內(nèi)外的研究表明白藜蘆醇具有多種藥理活性[3-8]，但由于其結(jié)構(gòu)中存在3 個(gè)酚羥基，其穩(wěn)定性較差，容易受到光和熱等因素的影響而被破壞；分子中3 個(gè)羥基的存在，使其脂溶性減弱；且臨床研究也表明白藜蘆醇在體內(nèi)的生物利用度低[9]，大部分的白藜蘆醇在肝臟和腸上皮細(xì)胞中被代謝成葡萄糖醛酸苷化和硫酸酯化的形式[10]，并失去了藥理活性[11]。 目前已經(jīng)有研究集中在白藜蘆醇的衍生物上，如與同樣具有藥理活性的羧酸進(jìn)行酯化，形成組合化合物，不僅提高了白藜蘆醇的穩(wěn)定性，而且能更好發(fā)揮兩種物質(zhì)的作用。

多不飽和脂肪酸 （Polyunsaturated fatty acids，PUFAs），如亞油酸、亞麻酸、DHA 等，具有降低血液膽固醇的作用，在預(yù)防心血管疾病方面具有特殊的功效[12]，臨床上一直是治療高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的有效藥物[13]，被稱為“血管清道夫”，人體一旦缺乏會(huì)引起機(jī)體生理失調(diào)而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[14]。但由于PUFAs 中多個(gè)雙鍵的存在，極易被氧化而失效，因而需要抗氧化劑進(jìn)行保護(hù)。 白藜蘆醇和PUFAs 的結(jié)合，一方面可以提高白藜蘆醇的親脂性、細(xì)胞穿透性和生物利用度[15]；而且由于PUFAs易于氧化，與白藜蘆醇的結(jié)合有助于限制其自動(dòng)氧化，防止脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的有害影響。 另一方面，用PUFA 對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行酯化是一種很好的掩蓋其羥基極性作用的方法，從而降低白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化或氧化降解的速度。 此外，酚類分子中結(jié)合PUFA 可提高親脂介質(zhì)中酚類化合物的抗氧化性能。 根據(jù)病理研究結(jié)果，兩者之間具有協(xié)同效應(yīng)[15]。

作者采用化學(xué)法合成了白藜蘆醇和亞麻酸、花生四烯酸以及DHA 等多種多不飽和脂肪酸的酯化產(chǎn)物，采用質(zhì)譜、紅外、氫譜、碳譜等確認(rèn)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，該研究為開發(fā)白藜蘆醇的酯類衍生物提供參考，也為進(jìn)一步研究其酯類衍生物的性質(zhì)及應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

白藜蘆醇、α-亞麻酸、花生四烯酸、DHA、氘代氯仿、氘代乙腈：上海阿拉丁生化科技有限公司產(chǎn)品；草酰氯、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（DCM）、三氟乙酸（TFA）、石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸、丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、甲醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純）：美國Tedia 天地試劑公司產(chǎn)品；薄層層析硅膠板（GF254）：青島海洋化工有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器與設(shè)備

傅里葉紅外光譜儀（Bruker TENSOR27）：布魯克光譜儀器公司產(chǎn)品；Agilent Technologies 1200 Series 液相色譜系統(tǒng)，Agilent Technologies 6224 精確質(zhì)量飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)，Agilent DD2 400-MR 核磁共振波譜儀：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；Waters Prep LC 4000 Preparative Chromatography System 制備液相：沃特世科技有限公司產(chǎn)品； 熔點(diǎn)儀WRS-1B：上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式三用紫外分析儀：上海一科儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

由于反應(yīng)主要原料白藜蘆醇和幾種不飽和脂肪酸都不太穩(wěn)定，以下實(shí)驗(yàn)均在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。

1.3.1 白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應(yīng) 三口瓶中，加入亞麻酸和18 mL DCM，冰水浴攪拌，滴加草酰氯和2 滴DMF，室溫反應(yīng)3 h。 另一三口瓶中，加入白藜蘆醇、11 mL DCM、三乙胺，冰水浴攪拌，滴加上述酰氯反應(yīng)液反應(yīng)2 h （TLC 監(jiān)控反應(yīng)至原料點(diǎn)較淡），加入 50 mL 0.5 mol/L HCl 攪拌 10 min 分液，有機(jī)相經(jīng)50 mL 水洗 1 次分液，再用50 mL 0.5 mol/L 碳酸氫鈉攪拌10 min 分液，最后用50 mL 水洗1 次，加無水硫酸鈉干燥30 min，過濾，40 ℃濃縮至干，粗品經(jīng)高效制備液相分離，得兩個(gè)亞麻酸酯產(chǎn)品，BL-亞麻酸酯 1 （120 mg）和 BL-亞麻酸酯 2 （80 mg），收率10%。

表1 白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應(yīng)主要物料Table 1 Main materials used in the reaction of resveratrol with linolenic acid

1.3.2 白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應(yīng) 三口瓶中，加入相應(yīng)脂肪酸和2 mL DCM，冰水浴攪拌，滴加草酰氯和1 滴DMF，室溫反應(yīng)3 h。 另一三口瓶中，加入白藜蘆醇、2 mL DCM、三乙胺，冰水浴攪拌，滴加上述酰氯反應(yīng)液反應(yīng)2 h （TLC 監(jiān)控反應(yīng)至原料點(diǎn)較淡）。 反應(yīng)完畢后，加入5 mL 0.5 mol/L NaOH 攪拌10 min 分液，洗去可能產(chǎn)生的部分單取代以及雙取代產(chǎn)物。 有機(jī)相經(jīng)5 mL 飽和食鹽水洗滌1 次分液，加無水硫酸鈉干燥30 min，過濾，40℃濃縮至干，粗品經(jīng)柱層析分離（PE∶EA=4∶1），得液態(tài)油狀產(chǎn)物白藜蘆醇花生四烯酸酯 15 mg，收率12.6%，液態(tài)油狀產(chǎn)物白藜蘆醇DHA 酯12 mg，收率10.2%。

表2 白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應(yīng)主要物料Table 2 Main materials used in the reaction of resveratrol with arachidonic acid/DHA

1.4 分析方法

最終反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)由質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）確定。反應(yīng)過程中用TLC 和HPLC 跟蹤分析。

1.4.1 TLC 條件 白藜蘆醇與亞麻酸的反應(yīng)：展開劑為 V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=2∶1，UV254 nm；白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 的反應(yīng)：展開劑為V（石油醚）∶V （乙酸乙酯）∶V （丙酮）=5∶1∶0.7，UV254 nm（原料和產(chǎn)物均可用高錳酸鉀顯色）。

1.4.2 HPLC 條件 白藜蘆醇與亞麻酸反應(yīng)混合物的 HPLC 條件為：柱溫 25 ℃；流量 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 230 nm，進(jìn)樣量 2 μL。 流動(dòng)相：A 為體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA-CH3CN，B 為體積分?jǐn)?shù) 0.1% TFA-H2O，梯度洗脫程序?yàn)椋? min 10∶90；10 min 100∶0；12 min 100∶0；20 min 10∶90。 純產(chǎn)物的梯度洗脫程序?yàn)椋? min 50∶50；10 min 90∶10；20 min 90∶10；23 min 50∶50。 樣品用乙腈溶解，過膜。

1.4.3 制備液相條件 白藜蘆醇與亞麻酸反應(yīng)后兩個(gè)產(chǎn)物的分離采用高效制備液相，條件為：Waters Prep LC 4000 Preparative Chromatography System，柱溫：25 ℃；流量：10 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：0.5 mL。 流動(dòng)相為 V（乙腈）∶V（水）=90∶10。 樣品用乙腈溶解，過膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應(yīng)產(chǎn)物鑒定

白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應(yīng)后，反應(yīng)液取樣經(jīng)HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)圖中有兩個(gè)大峰。 反應(yīng)混合物經(jīng)高效制備液相分離后得到兩個(gè)酯化產(chǎn)物，分別以BL-亞麻酸酯1 和BL-亞麻酸酯2 表示。 熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果顯示BL-亞麻酸酯1 的熔點(diǎn)為128℃，BL-亞麻酸酯2 的熔點(diǎn)為 145 ℃。

酯化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分別經(jīng)質(zhì)譜、 紅外、1H-NMR、13C-NMR 確定。

2.1.1 質(zhì)譜鑒定 白藜蘆醇的相對(duì)分子質(zhì)量為228，亞麻酸的相對(duì)分子質(zhì)量為278，如果成單酯化、二酯化和三酯化產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分別為488、748 和 1 014。 從質(zhì)譜結(jié)果來看，m/z=506 為單酯化產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子[M+NH4]+，分子式計(jì)算結(jié)果也顯示，兩個(gè)產(chǎn)物的匹配分?jǐn)?shù)最高達(dá)99.65%和98.86%對(duì)應(yīng)的分子式均為C32H44NO4，即2 個(gè)產(chǎn)物分子的分子式為C32H40O4，因此可初步確定兩產(chǎn)物為單酯化產(chǎn)物。

2.1.2 紅外光譜鑒定 圖1 為白藜蘆醇與亞麻酸反應(yīng)產(chǎn)物的紅外光譜圖。 從兩圖中看到，1 726 cm-1和1 750 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收帶及1 163 cm-1和1 152 cm-1的最強(qiáng)峰，說明分別為酯羰基C=O 的伸縮振動(dòng)特征峰以及酯中C-O-C 伸縮振動(dòng)吸收峰，可以判斷兩分子中均存在酯基；另外，兩圖中3 405 cm-1和3 272 cm-1分別出現(xiàn)較寬吸收峰，說明白藜蘆醇中還有游離羥基未參與反應(yīng)；兩圖的指紋區(qū)也比較清晰，676 cm-1和679 cm-1為順式烯氫面外變形振動(dòng)峰；965 cm-1和955 cm-1為反式烯氫面外變形振動(dòng)峰。 從紅外譜圖結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果可以判斷產(chǎn)物應(yīng)該為白藜蘆醇單亞麻酸酯，下面通過核磁譜圖進(jìn)一步確證。

圖1 白藜蘆醇與亞麻酸反應(yīng)產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig. 1 Infrared spectra of resveratrol and alpha-linolenic acid reaction product

2.1.31H-NMR 和13C-NMR 鑒定 圖 2 和圖 3 分別為BL-亞麻酸酯1（氘代乙腈）和BL-亞麻酸酯2（氘代氯仿）的1H-NMR 和13C-NMR 譜圖。圖 2 中各個(gè)質(zhì)子信號(hào)的歸屬都已標(biāo)出。

因白藜蘆醇與亞麻酸的單酯化產(chǎn)物只有兩種，從兩個(gè)產(chǎn)物的氫譜圖2 中可以看出，BL-亞麻酸酯1 的低場(chǎng)區(qū)明顯比BL-亞麻酸酯2 要復(fù)雜，可以判斷出BL-亞麻酸酯1 為3 位酯化產(chǎn)物，而BL-亞麻酸酯2 為4'位酯化產(chǎn)物。 進(jìn)一步經(jīng)過質(zhì)子歸屬，與之前的判斷一致。

以上結(jié)果與NMR 譜圖數(shù)據(jù)庫（www.nmrdb.org）預(yù)測(cè)結(jié)果吻合，通過以上分析，可以確證合成的產(chǎn)物1 為亞麻酸-3-白藜蘆醇酯，產(chǎn)物2 為亞麻酸-4'-白藜蘆醇酯。

2.2 白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應(yīng)產(chǎn)物鑒定

白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應(yīng)后，過柱后均得到油狀產(chǎn)物。

2.2.1 質(zhì)譜鑒定 從白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA酯化產(chǎn)物的質(zhì)譜結(jié)果來看，m/z=1 104 和m/z=1 176分別為兩個(gè)三酯化產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子 [M+NH4]+，分子式計(jì)算結(jié)果也顯示，2 個(gè)產(chǎn)物的匹配分?jǐn)?shù)最高達(dá)98.1%和99.57%對(duì)應(yīng)的分子式分別為C74H106NO6和C80H106NO6，即 2 個(gè)產(chǎn)物分子的分子式分別為C74H102O6和C80H102O6，因此可初步確定兩產(chǎn)物均為三酯化產(chǎn)物。

圖2 白藜蘆醇與亞麻酸反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振氫譜Fig. 2 1H NMR spectra of resveratrol and alpha-linolenic acid reaction product

圖3 白藜蘆醇與亞麻酸反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振碳譜Fig. 3 13C NMR spectra of resveratrol and alpha -linolenic acid reaction product

2.2.2 紅外光譜鑒定 圖4 為白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 酯化產(chǎn)物的紅外光譜圖。 從圖中同樣可以判斷出2 個(gè)分子中都存在酯基； 另外3 000 cm-1以上沒有寬峰，說明白藜蘆醇中的3 個(gè)羥基都已參與反應(yīng)。 從紅外譜圖結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果可以判斷兩產(chǎn)物均為三酯化產(chǎn)物，下面通過核磁譜圖進(jìn)一步確證。

圖 4 白藜蘆醇與（a）花生四烯酸/（b）DHA 反應(yīng)產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of resveratrol and （a）arachidonic acid/（b）DHA reaction product

2.2.31H-NMR 和13C-NMR 鑒定 圖 5～6 分別為白藜蘆醇和花生四烯酸/DHA 的1H-NMR 和13CNMR 譜圖（溶劑均為氘代氯仿）。圖5 中各個(gè)質(zhì)子信號(hào)的歸屬都已標(biāo)出。

以上結(jié)果與NMR 譜圖數(shù)據(jù)庫（www.nmrdb.org）預(yù)測(cè)結(jié)果吻合，通過以上分析，可以確證合成的產(chǎn)物分別為三花生四烯酸白藜蘆醇酯和三DHA 白藜蘆醇酯。

2.3 反應(yīng)機(jī)理

圖5 白藜蘆醇與(a)花生四烯酸/(b)DHA 反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振氫譜Fig. 5 1H-NMR spectra of resveratrol and （a）arachidonic acid/（b）DHA reaction product

圖6 白藜蘆醇與(a)花生四烯酸/(b)DHA 反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振碳譜Fig. 6 13C-NMR spectra of resveratrol and （a）arachidonic acid/（b）DHA reaction product

采用化學(xué)法成功合成了白藜蘆醇和3 種多不飽和脂肪酸的酯化產(chǎn)物，包括亞麻酸、花生四烯酸和DHA。 由于所用脂肪酸位阻較大，直接酯化困難，故先把脂肪酸制成相應(yīng)的酰氯，再與白藜蘆醇反應(yīng)成酯。

2.3.1 羧酸的酰化 酰氯是最活潑的?；噭谝恍人岵荒苓M(jìn)行或進(jìn)行非常緩慢的反應(yīng)中將羧酸制成酰氯使反應(yīng)活性和產(chǎn)率大大提高。 目前，制備酰氯的方法最常用的?；噭┯新然瘉嗧?、草酰氯、三氯化磷、五氯化磷、三光氣等，而草酰氯是一種較為活潑的?；噭?，它比氯化亞砜更綠色環(huán)保，可用于酸類和胺類物質(zhì)的?；?。

把羧酸和草酰氯室溫下攪拌混合，反應(yīng)比較平緩。 一旦加入少許DMF 催化后，就有氣泡產(chǎn)生，反應(yīng)比較劇烈。 DMF 加劇了反應(yīng)進(jìn)程，起到重要的催化作用，反應(yīng)機(jī)理如下：

當(dāng)草酰氯和DMF 合用時(shí)，其氯化劑的實(shí)際形式其實(shí)為上式的Vilsmeier-Haack 試劑，該試劑活性大、反應(yīng)迅速、選擇性好，以及能有效的結(jié)合反應(yīng)中生成的HCl 等優(yōu)點(diǎn)，故可作為良好的羧羥基置換試劑[16]。

生成的Vilsmeier-Haack 試劑再與羧酸反應(yīng)生成相應(yīng)的酰氯以及DMF，因此反應(yīng)中的DMF 起到催化的作用，其用量只需要催化量即可。 在整個(gè)酰化反應(yīng)中，因草酰氯不僅對(duì)空氣敏感，且遇到潮氣會(huì)發(fā)生分解放出HCl，遇水會(huì)劇烈分解，因此反應(yīng)中應(yīng)嚴(yán)格控水，所用溶劑均應(yīng)重蒸除水。

2.3.2 酰氯的醇解成酯 通過上步把羧酸制成相應(yīng)的酰氯后，反應(yīng)能力增強(qiáng)，適于位阻大的醇（酚）羥基酰化。 且白藜蘆醇和多不飽和脂肪酸之間的酯化，酚羥基由于受芳環(huán)的影響，使酚的親核性降低，其?；却家щy，需要用較強(qiáng)的?；瘎?。 酰氯的性質(zhì)雖然沒有酸酐穩(wěn)定，但因作者所用脂肪酸的酸酐難以制備，不宜采用酸酐法，因此將羧酸制備成酰氯后再與白藜蘆醇反應(yīng)。 由于反應(yīng)中有氯化氫釋放出來需要中和，所以本反應(yīng)在三乙胺（Et3N）存在下進(jìn)行。 三乙胺作為縛酸劑，以消除反應(yīng)中的氯化氫，有利于醇解反應(yīng)的進(jìn)行。 總的反應(yīng)歷程經(jīng)過兩步，一是酰基化合物和親核試劑（白藜蘆醇）的加成反應(yīng)得四面體中間體，二是四面體中間體的消除反應(yīng)成酯。 反應(yīng)歷程如下[17]：

3 結(jié) 語

多酚和多不飽和脂肪酸是兩類天然化合物，在流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)它們都對(duì)健康有益。 許多體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都報(bào)道了這兩類代謝產(chǎn)物具有生物活性。 因此，在過去的十幾年間，把這兩類化合物通過化學(xué)結(jié)合生成多酚不飽和脂肪酸酯，在很多領(lǐng)域中受到了重視。 如親水性藥物與多不飽和脂肪酸結(jié)合可有助于增加極性酚類藥物的親脂性、細(xì)胞穿透性和生物利用度。 另外，把多酚和一些本身具有生物活性的羧酸結(jié)合成酯，作為一種新型的、更安全的組合化合物，可以同時(shí)釋放多酚和羧酸。 因此，白藜蘆醇多不飽和脂肪酸酯也是增加其生物利用度的一種替代方法，可用于藥品、食品、保健品和化妝品中，對(duì)該領(lǐng)域的研究目前還在起步中。

用化學(xué)法，利用草酰氯把3 種多不飽和脂肪酸制成酰氯后再與白藜蘆醇反應(yīng)以制備相應(yīng)的酯，采用質(zhì)譜、紅外、氫譜、碳譜等測(cè)試手段首次確認(rèn)了四種白藜蘆醇多不飽和脂肪酸酯的結(jié)構(gòu)。 作者為開發(fā)白藜蘆醇的相關(guān)酯類產(chǎn)品提供了參考，也為進(jìn)一步探索其酯類產(chǎn)品的性質(zhì)及應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。