王志偉，郭媚下，周中凱

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

近年來，可生物降解納米晶和納米粒子的制備和應(yīng)用引起了人們越來越多的研究興趣。 淀粉作為一種典型的綠色可生物降解天然高分子，是制備納米晶和納米粒子的理想選擇。 目前制備方法主要有酸水解和酶解法，但是酸水解對環(huán)境有一定負(fù)面影響。Majian 等人[1]醇沉煮沸的土豆淀粉，得到50～100 nm的納米淀粉顆粒；Kim 等人[2]通過正丁醇和酶水解的結(jié)合的方法，得到的是10～20 nm 的粒子；但是現(xiàn)在越來越多學(xué)者為了避免使用化學(xué)試劑，采用普魯蘭酶酶解的方法。 普魯蘭酶又稱支鏈淀粉6-葡聚糖水解酶，可以裂解α-葡聚糖多糖，是一種廣泛存在的酶。 Shi等人[3]將糯玉米淀粉經(jīng)酶解后，在室溫下干燥，在45 ℃下干燥12 h，制得抗性淀粉，但粒徑約為0.8～2.0μm。研究發(fā)現(xiàn)，分枝短線性葡聚糖在低溫下通過冷凍干燥容易形成納米淀粉顆粒[3]。 目前通過酶解和再結(jié)晶制備納米淀粉顆粒的研究日漸深入，但重結(jié)晶自組裝機(jī)制的研究還較少。

作者以支鏈質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%的淀粉為原料，經(jīng)過糊化斷開其結(jié)晶區(qū)的氫鍵，打開分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)從有序狀態(tài)變得無序。 普魯蘭酶對支鏈淀粉的α-1，6 糖苷鍵專一水解從而進(jìn)行脫支，產(chǎn)生更多較為均一的短直葡聚糖鏈，從而易于老化重結(jié)晶。 采用分離重結(jié)晶淀粉水溶液的上清和沉淀，以SEM、FTIR 和 XRD 等技術(shù)手段研究不同溫度不同部分所獲得的淀粉結(jié)晶體的形態(tài)和物化性質(zhì)，進(jìn)行多方面表征和綜合分析，進(jìn)一步了解支鏈淀粉脫支后在水溶液自組裝過程。

1 材料與方法

1.1 原料

支鏈淀粉（來自蠟質(zhì)玉米）：美國C&M Biolabs公司產(chǎn)品；普魯蘭酶（1000 ASPU/mL）：丹麥Danisco公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器、數(shù)顯恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；立式蒸汽滅菌器：上海華線區(qū)用核子儀器有限公司產(chǎn)品； 臺式離心機(jī)：北京白洋醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；糖量計：上海米青科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥儀：賽默飛事爾科技有限公司產(chǎn)品；BT-9300H 激光粒徑分布儀：丹東百特儀器有限公司產(chǎn)品；X 射線衍射儀（XRD）：日本島津公司產(chǎn)品；丹東通達(dá)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀 （FTIR）：德國布魯克光譜儀公司產(chǎn)品；SU-1510 掃描式電子顯微鏡：日本日立公司產(chǎn)品；Q-50 熱重分析儀：沃特斯中國有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 樣品制備在Sun[4]等基礎(chǔ)上改進(jìn)。稱取2.5 g 支鏈淀粉，加入25 g 蒸餾水，先將淀粉沸水煮沸30 min 再經(jīng)過高溫高壓鍋處理30～40 min使其完全糊化，將糊化液放置水浴鍋恒溫至58 ℃，加入普魯蘭酶80 μL（參照文獻(xiàn)[5]，同樣實(shí)驗(yàn)條件下此添加量時脫支效果佳），在58 ℃恒溫水浴搖床完成12 h 脫支過程。脫支完成后再將反應(yīng)液之于高壓蒸汽滅菌鍋中滅酶30～40 min，分別置于4、25（常溫）、30、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中重結(jié)晶48 h。結(jié)晶完成后，離心分離，首先小心用吸管取得上清置于凍干平皿中，避免摻入沉淀；沉淀再用蒸餾水清洗3～4 次，同樣移入凍干平皿中。 預(yù)凍12～24 h 后經(jīng)冷凍干燥得到重結(jié)晶后上清和沉淀的凍干粉末樣品備用。

1.3.2 高效液相色譜分析重結(jié)晶前后清液分子分布 分別取脫支完成后和重結(jié)晶完成后的清液用于HPLC 測定[6]重結(jié)晶前后清液淀粉分子分布。 色譜柱為TSK-GEL-SW 凝膠柱，檢測器為示差折光檢測器。

1.3.3 重結(jié)晶上清液可溶性糖參于重結(jié)晶絮凝速率 在脫支淀粉溶液于 4、25（常溫）、30、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中重結(jié)晶的過程中，每隔12 h 取樣品液1 mL，10 000 r/min 離心10 min，用糖量計測量上清中可溶性糖的含量，每個時間點(diǎn)點(diǎn)測3 次求平均值，共測量5 個時間點(diǎn)。

1.3.4 重結(jié)晶沉淀的粒徑分布 取適量沉淀凍干物溶于蒸餾水中，超聲波震蕩30 min 后用于粒度分布測試。 添加溶液于激光粒徑分布儀中，緩慢滴加調(diào)整質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%后開始測定，經(jīng)計算機(jī)軟件處理得到粒徑分布數(shù)據(jù)。

1.3.5 重結(jié)晶上清和沉淀的形態(tài)觀察 采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行樣品形態(tài)觀察。 用棉簽輕輕蘸取各個樣品均勻且薄薄地涂抹在圓形托盤上的導(dǎo)電膠表面上，噴進(jìn)鍍膜，置于電子顯微鏡下觀察。 采取不同放大倍數(shù)進(jìn)行觀察拍照。

1.3.6 FTIR 分析重結(jié)晶上清和沉淀物理結(jié)構(gòu) 取樣品1 mg 加入適量溴化鉀充分研磨、壓片。 光譜范圍 4 000～400 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描次數(shù)：16。用OMNIC 軟件對所得圖譜進(jìn)行傅里葉去卷積處理分析。

1.3.7 X 射線射XRD 分析重結(jié)晶上清和沉淀的結(jié)晶結(jié)構(gòu) 取適量樣品置于掃描圓盤凹槽中，鋪平壓實(shí)待測。 測定條件：衍射角（2 θ）范圍，掃描范圍為5～35°，掃描速度為 1.2°/min，檢測步寬 0.02°，管壓30 KV，管流20 mA。 所得數(shù)據(jù)用Jade6.0 進(jìn)行分析處理。 參照文獻(xiàn)中[2]方法計算結(jié)晶度。

1.3.8 重結(jié)晶上清和沉淀的熱分析 稱取不同樣品均3 mg 左右裝入熱重天平籃中，通入90 mL/min流量的高純氮?dú)獯祾?，從常溫開始，以10 ℃/min 的升溫速度升至600 ℃，得到微分熱重曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對重結(jié)晶沉淀得率的影響

結(jié)晶體沉淀的得率是衡量淀粉分子重結(jié)晶難易程度的主要指標(biāo)之一。 溫度是影響淀粉自組裝過程的重要因素，因?yàn)榈矸鄯肿又嘏胚^程涉及了晶核生成、晶核增長和完美晶體結(jié)構(gòu)3 個過程，溫度影響淀粉分子的運(yùn)動，進(jìn)而影響到淀粉分子晶核的形成，以及晶核的增長速度和增長過程中分子的重排方式。 圖1 中可明顯看到隨著結(jié)晶溫度的升高越難絮凝，且得率也越低，40 ℃下只有不到10% 的得率，這可能由于在較高溫度下淀粉分子運(yùn)動較為劇烈，分子重排需要更高的能量來完成，最終降低淀粉的結(jié)晶率，甚至當(dāng)升高到一定溫度幾乎不會絮凝產(chǎn)生重結(jié)晶體。

圖1 不同溫度重結(jié)晶沉淀得率Fig. 1 Recrystallization precipitation yield at different temperature

2.2 溫度對重結(jié)晶上清液可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

支鏈淀粉經(jīng)過酶解脫支后，因可溶性糖溶于水因此使用糖度計可測出上清液中可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 圖2 中看到，不同溫度下重結(jié)晶的淀粉溶液上清中的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)會隨著重結(jié)晶的進(jìn)行而發(fā)生不同趨勢的降低變化，說明支鏈淀粉脫支后溶液有可溶性糖且會逐步參與到重結(jié)晶沉淀的絮凝中，變化快慢也與可溶性糖參于重結(jié)晶沉淀結(jié)晶的速率一致。4 ℃環(huán)境下，前12 小時降低幅度很大，隨溫度升高，降低趨勢減緩。 這里的討論不包括不可溶性糖參于結(jié)晶的情況，以后還需繼續(xù)全面深刻地研究。

圖2 不同溫度重結(jié)晶上清液可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig. 2 Changes of soluble sugar content in supernatant of recrystallization from different temperature

2.3 溫度對重結(jié)晶沉淀粒徑分布的影響

d50 為顆粒中位徑，數(shù)值越大表示顆粒群顆粒大；（d90-d10）/d50 用來表征大小顆粒差異程度，即離散程度離散程度越小，粒度分布范圍越窄，粒徑越集中，顆粒均一性越好[7]。 原淀粉粒徑 13.5 μm 左右，離散程度1.47，原淀粉顆粒均一性較好。 脫支后，粒徑均減小，但是均一性變差。 低溫4 ℃下重結(jié)晶得到的沉淀粒徑最小，離散程度最小，顆粒均一性最好。

2.4 溫度對重結(jié)晶沉淀和上清液形態(tài)的影響

圖3 可見，上清液顆粒較沉淀顆粒大。 低溫4 ℃下，上清液為表面光滑片狀和少量圓棒狀，溫度升高仍為片狀但是放大倍數(shù)下顯示為大小均勻的圓形顆粒聯(lián)結(jié)狀，在30 ℃下顆粒較大；不同溫度下得到的沉淀顆粒則均為為微小米粒狀，大小差異不大，隨溫度升高到40 ℃，顆粒接近微球狀。

圖3 不同溫度上清液的電鏡對比圖Fig. 3 Comparison of different temperature and electronmicroscope supernatant and precipitation

2.5 XRD 衍射圖譜分析

2.5.1 溫度對重結(jié)晶沉淀結(jié)晶度及晶型的影響 原支鏈淀粉（native strach，NS）衍射峰 15°、17°、 18°、23°，表現(xiàn)出典型的 A 型結(jié)構(gòu)。 如圖 4 所示，不同溫度重結(jié)晶淀粉沉淀X-射線衍射峰減少，4 ℃、常溫、30 ℃均為B 型，溫度到40 ℃則為B+V，相對結(jié)晶度達(dá)到69 %。那么確認(rèn)脫支重結(jié)晶淀粉沉淀物含有部分有序的晶體結(jié)構(gòu)，而且較原淀粉結(jié)晶度隨溫度的升高而增大。 分子間的作用力被更多的氫鍵強(qiáng)化，因此需要更多的能量來破壞結(jié)構(gòu)[8]。

圖4 不同溫度重結(jié)晶淀粉沉淀衍射圖譜Fig. 4 Diffraction pattern of recrystallization starch precipitation at different temperature

2.5.2 溫度對重結(jié)晶上清液結(jié)晶度及晶型的影響 圖5 顯示，溫度對上清物影響較大，低溫下淀粉溶液絮凝速度快，上清物質(zhì)圖譜為饅頭峰，成為非晶物質(zhì)。而結(jié)晶溫度升高，不易絮凝，有著幾乎類似的X-射線衍射圖案，在17°和22°有衍射峰，表明上清液淀粉分子也存在重結(jié)晶行為，顯示為B 型結(jié)晶。

圖5 不同溫度重結(jié)晶淀粉上清液衍射圖譜Fig. 5 Diffraction pattern of recrystallization starch supernatant at different temperature

重結(jié)晶是個復(fù)雜的過程，包括構(gòu)象的變化，鏈排列、晶體堆積、相位傳播[9]。 另一方面，脫支釋放短線性聚合物，有利于晶體重結(jié)晶，較長的直鏈淀粉鏈更快形成網(wǎng)絡(luò)，阻礙晶粒有序生長。 隨著淀粉濃度的增加，短鏈直鏈淀粉往往形成更好的雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，但隨著溫度的降低，直鏈淀粉分子鏈的運(yùn)動劇烈程度增加受到抑制，這可能導(dǎo)致了淀粉沉淀的相對結(jié)晶度降低。 上清液也表現(xiàn)出這樣的趨勢，而且相對于原淀粉和重結(jié)晶沉淀結(jié)晶度明顯降低了，可能與上清液是較長的直鏈淀粉形成網(wǎng)絡(luò)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不夠有序有關(guān)。

2.6 紅外分析

將不同溫度的上清和沉淀凍干樣進(jìn)行紅外測定，利用OMNIC 軟件對紅處的外圖譜進(jìn)行傅里葉去卷積處理，可以有效分析淀粉分子鏈構(gòu)象和雙螺旋結(jié)構(gòu)的改變。 在紅外圖譜中1 047 cm-1處的吸收峰是結(jié)晶區(qū)的特征吸收峰，代表了分子內(nèi)的有序結(jié)構(gòu)； 在1 022 cm-1處的吸收峰是非結(jié)晶區(qū)的特征吸收峰；996～1 000 cm-1處的吸收峰是 C-OH 的彎曲震動。 1 047cm-1/1 022cm-1，1 022cm-1/998cm-1被稱作淀粉結(jié)構(gòu)因子指數(shù)[10]，這是綜合考慮3 個特征峰得到的。 圖中用c 表示，是描述淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的綜合指標(biāo)。從圖中可以看出，重結(jié)晶沉淀a 值和c 值均隨著溫度升高呈現(xiàn)增大趨勢，這說明隨著溫度變大，重結(jié)晶體沉淀相對結(jié)晶程度升高，分子排列的有序性升高，即溫度越低，絮凝越快速，分子重排所用時間越短，短時間的快速重排就導(dǎo)致了分子鏈之間雙螺旋結(jié)構(gòu)和相互交聯(lián)的無序性，反之，溫度溫度越高，高分子鏈之間形成雙螺旋的交聯(lián)所需時間越長，這樣由短鏈的直鏈淀粉重新組裝成的重結(jié)晶沉淀顯得有序和完美；而不同溫度分別對應(yīng)的上清液 a、c 值在 30 ℃以下，呈現(xiàn)相同趨勢，40 ℃發(fā)生下降，同樣可以看到上清中也形成了與沉淀空間結(jié)構(gòu)不同的重結(jié)晶，因此懸浮在上清液中，較高溫度（40℃）下，可能由于溫度高，空間結(jié)構(gòu)松散，分子活動性高，導(dǎo)致上清的有序性降低。

圖6 上清液和沉淀的相關(guān)紅外指標(biāo)Fig. 6 FTIR indicators of supernatant and precipitation

2.7 熱穩(wěn)定性分析

如圖7、8 分別為重結(jié)晶不同溫度沉淀和上清液的TGA、DTG 曲線。 圖7 中可以看到有2 個質(zhì)量損失。 第1 個在50 ℃到110 ℃，在樣品的起始溫度下降之前，與水的蒸發(fā)有關(guān)。 第2 個在170 ℃到310℃，這個分解過程主要與顆粒大小和分子間作用力影響有關(guān)[11]。 圖8 顯示的是不同條件下最大降解速率的溫度，較高的溫度通常代表更大的穩(wěn)定性[12]。原淀粉分解溫度在344 ℃，經(jīng)過脫支和重結(jié)晶，最大降解速率的溫度降低。 上清液降低幅度大于沉淀，表明重結(jié)晶后熱穩(wěn)定性降低。 所有重結(jié)晶樣品在一個更寬范圍內(nèi)進(jìn)行。 天然樣品的降解溫度較高，但溫度范圍窄。 一個可能的解釋是，天然淀粉顆粒表面致密，緊湊的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由直鏈淀粉和淀粉果膠，因此需要更多的熱量來完成相變。 沉淀的最大速率降解溫度隨著結(jié)晶溫度的升高呈下降趨勢，而上清則是隨著結(jié)晶溫度升高而升高。 這與2.1 中敘述溫度越高重結(jié)晶淀粉愈難于絮凝是有很大關(guān)系的，溫度愈高，沉淀難以絮凝，所含淀粉物質(zhì)少，穩(wěn)定性越差；上清則所含淀粉多，穩(wěn)定性就相對越強(qiáng)。

圖7 不同溫度重結(jié)晶淀粉沉淀和上清的TGA 曲線Fig. 7 TGA curves of starch precipitation and supernatant after recrystallization at different temperature

圖8 不同溫度重結(jié)晶淀粉沉淀和上清液的DTG 曲線Fig. 8 DTG curves of starch precipitation and supernatant after recrystallization at different temperature

2.8 溫度對重結(jié)晶前后清液分子分布影響

淀粉經(jīng)過脫支后，淀粉溶液為澄清狀，采用高效液相色譜法測得脫支后上清液相對分子質(zhì)量分布如圖9 所示，48 h 重結(jié)晶完成后離心清液相對分子質(zhì)量分布如圖9（b）所示。出峰時間可以代表某一種相對分子質(zhì)量的組分，峰面積大小可以反映組分含量多少。圖中所示，從結(jié)晶前有出峰時間為21.0 min（組分 A）、23.5 min （組分 B） 到結(jié)晶后的 16.9 min（組分Ⅰ）和19.4 min（組分Ⅱ），出峰時間提前，重結(jié)晶完成后清液組分發(fā)生變化，清液中變成相對分子質(zhì)量更大的組分，且重結(jié)晶溫度對上清中兩個主要組分含量有一定影響。

在較高溫度40 ℃下，組分Ⅰ不存在；其他溫度下，隨溫度升高而升高，常溫與30 ℃差別較??；組分Ⅱ也是隨溫度升高而升高。 可知隨著溫度不同上清中淀粉小分子隨著重結(jié)晶時間延長參于到重結(jié)晶沉淀的凝絮，結(jié)晶后清液中則是相對分子質(zhì)量更大的淀粉分子。

圖9 不同溫度重結(jié)晶前后清液分子分布Fig. 9 Molecular distribution of supernatant before and after recrystallization

3 結(jié) 語

通過對支鏈淀粉脫支重結(jié)晶后上清和沉淀的多方面表征分析，來認(rèn)識溫度對淀粉分子重結(jié)晶特性的影響。 主要結(jié)論如下：支鏈淀粉酶解脫支重結(jié)晶低溫（4 ℃）下絮凝速度快且沉淀得率高，上清中可溶性糖參于沉淀絮凝且隨溫度升高速度減慢；重結(jié)晶完成后清液組分發(fā)生變化，清液中變成相對分子質(zhì)量更大的組分，且重結(jié)晶溫度對上清中兩個主要組分含量有一定影響，隨著溫度不同上清中淀粉小分子隨著重結(jié)晶時間延長參于到重結(jié)晶沉淀的凝絮，結(jié)晶后清液中則是相對分子質(zhì)量更大的淀粉分子。 不同溫度下重結(jié)晶得到的淀粉沉淀，顆粒則均為為微小米粒狀，大小差異不大，40 ℃顆粒接近微球狀。與原淀粉相比粒徑均減小，均一性變差。低溫（4 ℃）重結(jié)晶得到的沉淀粒徑最小，離散程度最小，顆粒均一性最好。 可而上清顆粒要比沉淀顆粒大，低溫上清為表面光滑片狀和少量圓棒狀，溫度升高仍為片狀但是放大倍數(shù)下顯示為大小均勻的圓形顆粒聯(lián)結(jié)狀。XRD 分析脫支重結(jié)晶淀粉沉淀物含有部分有序的晶體結(jié)構(gòu)，而且較原淀粉相對結(jié)晶度隨重結(jié)晶溫度升高而增大，低溫4 ℃上清物質(zhì)失去淀粉結(jié)晶性，常溫升高到40 ℃結(jié)晶度也逐漸變大。 紅外分析顯示沉淀和上清結(jié)構(gòu)有序性隨溫度升高增強(qiáng)，與XRD 結(jié)果呼應(yīng)。 熱重分析顯示沉淀的最大速率降解溫度隨著結(jié)晶溫度的升高呈下降趨勢，而上清液則是隨著結(jié)晶溫度升高而升高。