吳 凡， 王 月， 陳 閩， 劉 佳， 杭悅宇， 孫小芹

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

水稻(OryzasativaLinn.)的稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的一種真菌性病害[1]。目前，研究人員已經(jīng)鑒定出約100個抗稻瘟病基因，定位于除3號染色體外的其他11條染色體上[2]，并成功克隆出Pib、Pita、Pb1、Pi9、Pi2、Pizt和Pid2等27個抗稻瘟病基因[3-4]。Pita基因是繼Pib基因之后第2個被克隆出來的抗稻瘟病基因，其表達(dá)產(chǎn)物與稻瘟病菌的無毒基因AVR-Pita的表達(dá)產(chǎn)物相互作用，激活抗病防御基因表達(dá)，從而抑制水稻稻瘟病發(fā)生[5]。Pita基因是一個包含2個外顯子和1個內(nèi)含子的單拷貝顯性基因，定位于水稻12號染色體近著絲點的區(qū)域[6]；Pita基因編碼NBS-LRR類蛋白，其功能受到氨基酸位點的控制，當(dāng)?shù)?18位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸時，該基因功能喪失[6]。此外，不同水稻個體的Pita基因存在大量的單核苷酸多態(tài)性位點，導(dǎo)致水稻對稻瘟病菌的抗性存在個體間差異[7-8]。

CRISPR/Cas9是一種基因編輯系統(tǒng)，能夠為農(nóng)作物遺傳改良提供高效、快速的遺傳操作工具[9]，已應(yīng)用于多種模式植物和農(nóng)作物的基因敲除[10-14]。楊海河等[15]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對粳稻品種‘日本晴’(O.sativasubsp.japonica‘Nipponbare’)的pi21基因進(jìn)行編輯，從T1代轉(zhuǎn)基因株系中篩選獲得pi21純合突變體；韓嬌等[16]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻Pht3亞家族磷轉(zhuǎn)運蛋白基因OsPht進(jìn)行編輯，成功獲得目標(biāo)基因堿基缺失突變體；黃忠明等[17]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對粳稻溫敏不育基因TMS5進(jìn)行編輯，獲得tms5突變體；白建江等[18]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻2號染色體上的淀粉分支酶基因SBE3進(jìn)行編輯，獲得高抗性淀粉純合突變體。Pita基因為稻瘟病抗性基因，對Pita基因進(jìn)行研究有利于研究者對水稻抗稻瘟病機(jī)制的了解，然而，目前尚未見利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻抗稻瘟病基因Pita的研究報道。

鑒于此，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對粳稻品種‘日本晴’Pita基因的第6至第25位堿基進(jìn)行定點編輯，對突變體進(jìn)行鑒定，篩選出不含T-DNA區(qū)的純合突變體，并對該基因純合突變體的稻瘟病抗性及6個稻瘟病病程相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，以期明確Pita基因在水稻抵御稻瘟病中的作用，為水稻良種選育及品質(zhì)改良提供材料。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究以稻瘟病感病品種‘日本晴’為轉(zhuǎn)基因受體材料；供試的粳稻品種‘日本晴’和秈稻品種‘9311’(O.sativasubsp.indica‘9311’)均由南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院田大成教授饋贈。實驗使用的真核表達(dá)載體pGREB31購自美國Addgene公司；大腸桿菌DH5α購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，農(nóng)桿菌LBA4404為本實驗室保存的菌株；稻瘟病菌小種CH199(Magnaportheoryzaestrain CH199)由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所何祖華教授提供。實驗涉及的所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1Pita基因靶位點設(shè)計 利用CRISPR-P在線工具(http：∥crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/SCORE)設(shè)計Pita基因的靶位點[19-21]，選擇評分較高且位于Pita基因5′端的第6至第25位堿基序列(5′-GCCGGCGGTCAGTGCATCGC-3′)作為靶位點。根據(jù)Cas-OFFinder和BLAST分析結(jié)果確認(rèn)不存在脫靶效應(yīng)。

1.2.2 pTGE1表達(dá)載體的構(gòu)建 利用CRISPR-P在線工具設(shè)計Pita基因的gRNA序列(g11S序列為5′-GGCAGCCGGCGGTCAGTGCATCGC-3′，g11AS序列為5′-AAACGCGATGCACTGACCGCCGGC-3′)；將合成的g11S和g11AS等量混合，制備雙鏈接頭；與經(jīng)過BsaⅠ酶切的pGREB31載體連接，獲得pTGE1表達(dá)載體(圖1)。

LB： T-DNA的左邊界Left boundary of T-DNA；HPTⅡ： 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HygromycinBphosphotransferasegene； OsU3：gRNA： OsU3啟動子與引導(dǎo)RNA的融合結(jié)構(gòu)Fusion structure of OsU3 promoter and guide RNA；Cas9： CRISPR相關(guān)蛋白核酸酶9基因CRISPR-relatedproteinnuclease9gene； RB： T-DNA的右邊界Right boundary of T-DNA.

圖1Pita基因編輯載體pTGE1的T-DNA區(qū)

Fig. 1 T-DNA region ofPitagene editing vector pTGE1

1.2.3 T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的獲得與驗證 以野生型‘日本晴’的成熟胚為外植體，將構(gòu)建的pTGE1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中并進(jìn)行侵染，采用質(zhì)量濃度50 mg·L-1潮霉素進(jìn)行篩選，獲得再生組培苗，煉苗后移栽到土壤中，置于溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為晝溫30 ℃、夜溫28 ℃、空氣相對濕度70%、光照度30 000 lx、光照時間16 h·d-1。

取移栽后存活再生苗的新鮮葉片，采用CTAB法[22]提取總DNA。以T-DNA區(qū)域的Cas9基因序列為模板設(shè)計1對PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行陽性鑒定。其中，引物Cas9S的序列為5′-TGGTGGAAGAGGATAA

GAAGC-3′，引物Cas9AS的序列為5′-TCAAACAGT

GTCAGGGTCAGC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 突變體鑒定 設(shè)計1對跨越靶位點的引物對T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的Pita基因進(jìn)行擴(kuò)增。其中，引物Pita787的序列為5′-TGCCTACTTCTTTCCACAT

CA-3′，引物Pita1900的序列為5′-ATCCGAAGACTG

ATGCTGATGTT-3′。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，用Sequencher 4.5軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，統(tǒng)計突變類型和突變體類型。

1.2.5 不含T-DNA區(qū)的純合突變體篩選 利用引物Pita787和Pita1900擴(kuò)增Pita基因編輯位點上、下游的DNA片段，對T-DNA陰性植株進(jìn)行Pita基因突變位點鑒定。具體操作如下：播種T0代純合突變體植株自交獲得的T1代種子，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果確定T-DNA陰性植株，從T1代T-DNA陰性植株各株系材料中分別隨機(jī)選擇3株植株，對其DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，隨機(jī)選取4個單克隆進(jìn)行測序。若4個單克隆中Pita基因編輯位點的堿基突變完全一致，則判定為純合突變體。按照上述方法對T2代植株進(jìn)行檢測，確定Pita基因編輯材料是否穩(wěn)定遺傳。

1.2.6 純合突變體對稻瘟病的抗性分析 將稻瘟病菌小種CH199進(jìn)行活化培養(yǎng)，待培養(yǎng)至第12天時洗脫并收集稻瘟病菌的孢子，調(diào)整至1 mL溶液中包含2.5×105個孢子[23]，用于樣株的稻瘟病菌噴霧接種。分別以抗稻瘟病的秈稻品種‘9311’和野生型‘日本晴’為對照進(jìn)行稻瘟病抗性分析。取健康飽滿的‘9311’、野生型‘日本晴’和基因編輯材料V1-38-5的T2代植株種子進(jìn)行萌發(fā)，發(fā)芽5 d后移栽到土壤中，在同一盆中分區(qū)種植，每個區(qū)種植10株；移栽8 d后進(jìn)行稻瘟病菌噴霧接種，接種稻瘟病菌5 d后對每個區(qū)的樣株分別進(jìn)行病級調(diào)查及評定，最終計為樣株的平均病級[24]。

1.2.7 純合突變體稻瘟病病程相關(guān)基因的相對表達(dá)量分析 分別在接種稻瘟病菌小種CH199的0(未接種)、12和24 h時采集基因編輯材料V1-38-5的T2代植株和野生型‘日本晴’植株的嫩葉，用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以EF-257基因為內(nèi)參基因[15]，采用qRT-PCR技術(shù)檢測水稻稻瘟病菌病程相關(guān)基因PR2[25]、PR1b[26]、PR3[27]、PDR(引物F的序列為5′-ATCCACTCACCGCAAGTAACAG-3′，引物R的序列為5′-CTCCAGGAAGACCAACTAAAGCA-3′)、PBZ1[28]和E2F[29]的表達(dá)水平。采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對病級和各病程相關(guān)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 水稻Pita基因突變體鑒定

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對‘日本晴’的Pita基因進(jìn)行編輯，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法將Pita基因編輯載體pTGE1轉(zhuǎn)化到野生型‘日本晴’的成熟胚中，經(jīng)過潮霉素篩選及PCR擴(kuò)增，共獲得8株T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株。

使用引物Pita787和Pita1900對獲得的8株T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序和鑒定結(jié)果(表1)顯示：有7株T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的Pita基因發(fā)生了突變，突變率為87.5%；經(jīng)鑒定，在這7株突變體中，有1株為雜合體，6株為純合體，純合突變率為85.7%。突變類型包括堿基置換、堿基插入和堿基缺失。

表1 粳稻品種‘日本晴’Pita基因突變體的測序和鑒定結(jié)果

Table 1 Sequencing and identification results of mutants ofPitagene inOryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’

編號No.突變位置1)Mutation position1)突變情況Mutation status突變類型Mutation type突變體類型Mutant typeV1-2621st,22ndAT置換成G AT substituting to G堿基置換Base substitution純合體 HomozygoteV1-2921st,22ndAT置換成G AT substituting to G堿基置換Base substitution純合體 HomozygoteV1-3520th,21stT插入 T insertion堿基插入Base insertion純合體 HomozygoteV1-3820th,21stT插入 T insertion堿基插入Base insertion純合體 HomozygoteV1-3920th,21stT插入 T insertion堿基插入Base insertion純合體 HomozygoteV1-4720th,21stT插入 T insertion堿基插入Base insertion純合體 HomozygoteV3-5520th,21stCA缺失 CA deletion堿基缺失Base deletion雜合體 Heterozygote

1)從起始密碼子開始的堿基位置Base position from start codon.

2.2 不含T-DNA區(qū)的純合突變體篩選

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果共獲得42株T1代T-DNA陰性植株(部分檢測結(jié)果見圖2)，經(jīng)鑒定這42株T1代T-DNA陰性植株全部為純合突變體。同樣，從來源于基因編輯材料T1代V1-38-5自交的T2代植株中，隨機(jī)選取8株進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序分析，結(jié)果(圖3)顯示這8株T2代植株全部為純合突變體，說明Pita基因編輯材料遺傳穩(wěn)定。

2.3 純合突變體對稻瘟病的抗性分析

以抗稻瘟病秈稻品種‘9311’和野生型‘日本晴’為對照，對Pita基因編輯材料V1-38-5的T2代(即純合突變體)進(jìn)行稻瘟病菌小種CH199接種，并對其稻瘟病抗性進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4)顯示：接種稻瘟病菌小種CH199后，‘9311’的葉片沒有出現(xiàn)病斑，平均病級為0.0±0.0，說明‘9311’未感??；野生型‘日本晴’的葉片病斑面積較小，平均病級為3.0±0.2，表現(xiàn)為輕度至中度感?。籚1-38-5的T2代植株葉片病斑面積較大，平均病級為4.1±0.2，表現(xiàn)為重度感病。V1-38-5的T2代植株的平均病級與野生型‘日本晴’和‘9311’在統(tǒng)計學(xué)上存在極顯著(P<0.01)差異，說明Pita基因被編輯后 ‘日本晴’對稻瘟病菌的抗性降低。

2.4 純合突變體稻瘟病病程相關(guān)基因的相對表達(dá)量分析

qRT-PCR分析結(jié)果(圖5)表明：與未接種稻瘟病菌(0 h)時相比，基因編輯材料V1-38-5的T2代植株P(guān)R2、PR1b、PR3、PDR、PBZ1和E2F6個稻瘟病病程相關(guān)基因的相對表達(dá)量均在接種稻瘟病菌12和24 h時明顯升高；野生型‘日本晴’PR2基因的相對表達(dá)量在接種稻瘟病菌24 h時明顯升高，其PR3和E2F基因的相對表達(dá)量在接種稻瘟病菌12和24 h時也明顯升高，而其PR2基因的相對表達(dá)量在接種稻瘟病菌12 h時明顯降低，其PR1b、PDR和PBZ1基因的相對表達(dá)量在接種稻瘟病菌12和24 h時也明顯降低。

M： DNA標(biāo)記 DNA marker； 1： 陰性對照 Negative control； 2-12，14-24： T-DNA陽性植株 T-DNA positive plants； 13： T-DNA陰性植株T-DNA negative plant.

圖2 粳稻品種‘日本晴’Pita基因編輯材料V1-38-5的T-DNA陰性植株的部分檢測結(jié)果

Fig. 2 Partial detection result of T-DNA negative plants ofPitagene editing material V1-38-5 ofOryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’

圖3 粳稻品種‘日本晴’Pita基因編輯材料V1-38-5的T2代植株純合突變體鑒定

Fig. 3 Homozygous mutant identification of T2generation plants ofPitagene editing material V1-38-5 ofOryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’

9311： 秈稻品種‘9311’Oryzasativasubsp.indica‘9311’； WT： 野生型 ‘日本晴’ Wild type of ‘Nipponbare’； V1-38-5：Pita基因編輯材料V1-38-5的T2代植株T2generation plants ofPitagene editing material V1-38-5.

圖4 接種稻瘟病菌小種CH199后粳稻品種‘日本晴’Pita基因編輯材料V1-38-5的T2代植株抗性分析

Fig. 4 Resistance analysis on T2generation plants ofPitagene editing material V1-38-5 ofOryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’ after inoculatingMagnaportheoryzaestrain CH199

圖5 接種稻瘟病菌小種CH199后粳稻品種‘日本晴’Pita基因編輯材料V1-38-5的T2代植株病程相關(guān)基因的表達(dá)分析

Fig. 5 Analysis on expression of pathogenesis-related genes in T2generation plants ofPitagene editing material V1-38-5 ofOryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’ after inoculatingMagnaportheoryzaestrain CH199

比較發(fā)現(xiàn)，與野生型‘日本晴’相比，基因編輯材料V1-38-5的T2代植株P(guān)R2和PR1b基因的相對表達(dá)量在接種稻瘟病菌12 h時較低，其PR2、PR1b、PR3和E2F基因的相對表達(dá)量在接種稻瘟病菌24 h時也較低。

3 討論和結(jié)論

稻瘟病既是水稻易遭受的嚴(yán)重病害之一，也是限制水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的重要因子。Pita基因是水稻中的單拷貝抗稻瘟病基因，因此，研究Pita基因有助于人們更好地了解稻瘟病的發(fā)生機(jī)制。CRISPR/Cas9技術(shù)可通過編輯目的基因改良農(nóng)作物的農(nóng)藝性狀，利用CRISPR/Cas9技術(shù)開發(fā)的遺傳材料常存在多種突變類型[30]，可為植物育種研究提供豐富的遺傳材料。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻Pita基因進(jìn)行了編輯，結(jié)果表明：T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的Pita基因突變率達(dá)87.5%，且T0代的純合突變率高達(dá)85.7%；突變類型包括堿基置換、堿基插入和堿基缺失，并且這些突變可穩(wěn)定遺傳。

相關(guān)研究[5-6]表明：Pita基因通過特異性識別AVR-Pita可產(chǎn)生超敏反應(yīng)，激活抗病防御基因的表達(dá)，并且Pita基因第918位氨基酸的突變決定了該基因?qū)VR-Pita的識別特異性，當(dāng)該位點的丙氨酸被絲氨酸取代后，Pita基因與AVR-Pita的互作被削弱，從而導(dǎo)致水稻感染稻瘟病。本研究使用的轉(zhuǎn)基因受體材料為‘日本晴’，其Pita基因的第918位為絲氨酸，接種稻瘟病菌IC17后表現(xiàn)為重度感病[7]，接種稻瘟病菌小種81278ZB15和GUY11后表現(xiàn)為抗病[31]，本研究接種稻瘟病菌小種CH199后則表現(xiàn)為輕度至中度感病，推測這可能是由于使用的稻瘟病菌小種不同所致。本研究中，‘日本晴’Pita基因編輯材料V1-38-5的T2代植株表現(xiàn)為重度感病，這可能是因為Pita基因的N端發(fā)生了堿基非3整數(shù)倍的替代、插入或缺失，致使該基因的編碼框提前終止，從而導(dǎo)致植株喪失抗稻瘟病菌的能力。另外，‘日本晴’Pita基因編輯材料V1-38-5的T2代植株各病程相關(guān)基因的相對表達(dá)量總體上明顯低于野生型‘日本晴’，說明水稻Pita基因的突變可能影響病程相關(guān)基因?qū)Φ疚敛【拿舾行?，?dǎo)致植株抗病能力下降，更易感病。

綜上所述，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻Pita基因進(jìn)行定點編輯，能夠獲得穩(wěn)定遺傳且更易感病的純合突變體材料，這些材料為水稻抗性品種選育和品質(zhì)改良奠定了材料基礎(chǔ)，從而在一定程度上加速水稻定向分子育種的進(jìn)程。