孔子藝， 王 鵬， 朱軍生， 國 棟， 遲秀麗， 孔寶玉， 胡 磊， 褚 棟*

1山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109； 2山東省植物保護(hù)總站，山東 濟(jì)南 250100； 3膠州市農(nóng)業(yè)局植保站，山東 膠州 266300

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(Smith)，又稱秋粘蟲，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)(Nagoshietal.,2017b)，近年來成為一種重大入侵農(nóng)業(yè)害蟲。受國際交流、進(jìn)出口貿(mào)易和季風(fēng)氣候的影響，該蟲于2016年首次在非洲出現(xiàn)，后擴(kuò)散到撒哈拉以南的大部分國家以及亞洲的印度、也門、緬甸等國家(郭井菲等，2018； Goergenetal.,2016)。2018年年底該蟲零星傳入我國云南(吳秋琳等，2019)，隨后在國內(nèi)擴(kuò)散蔓延。截至2019年7月5日，已入侵我國22個省的1128個縣區(qū)，危害面積達(dá)55.6萬hm2(王磊等，2019)。草地貪夜蛾具有雜食性、遷飛性、暴發(fā)性以及繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)，能危害多種植物，尤其導(dǎo)致玉米等禾本科作物嚴(yán)重減產(chǎn)(郭井菲等，2019a)，對我國玉米等作物安全生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。當(dāng)前，全國各地廣泛開展了草地貪夜蛾的田間調(diào)查與監(jiān)測工作，預(yù)防其進(jìn)一步的擴(kuò)散蔓延。

最近國內(nèi)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾與甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner、斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)、粘蟲Mythimnaseparata(Walker)?；旌习l(fā)生，形態(tài)極為相似，而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法受到多種因素的影響，在調(diào)查時易將這4種害蟲混淆，不能準(zhǔn)確快速地識別(郭井菲等，2019b)。因此，該蟲的田間調(diào)查、監(jiān)測亟需快速準(zhǔn)確的識別技術(shù)。目前，物種分子鑒定包括擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphisms， AFLP)(楊兆富和張雅林，2005)、磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因(triosephosphate isomerase， Tpi)(Nagoshietal., 2012)以及線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因(mitochondrial cytochrome oxidase subunit I, mtCOI)(馬英等，2018； Meagher & Gallo-Meagher,2003)測序等方法。近年來，PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)(秦麗等，2013)、SCAR(sequence characterized amplified region)(劉循等，2009)等方法也常用于種間快速鑒別。

本研究首先下載并比對了草地貪夜蛾與甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲的mtCOI基因序列(截至2019年6月19日)，其次分析了草地貪夜蛾mtCOI基因序列的酶切位點(diǎn)，篩選確定了能區(qū)分該蟲與其他3種害蟲的候選酶切位點(diǎn)，然后根據(jù)mtCOI基因目的片段設(shè)計(jì)出新的上游引物并進(jìn)行PCR-RFLP驗(yàn)證。結(jié)果表明構(gòu)建的mtCOI PCR-RFLP方法可快速將草地貪夜蛾從其他3個形態(tài)相近昆蟲中鑒別出。本研究結(jié)果為近期傳入我國的草地貪夜蛾的快速鑒別提供了方法。

1 材料與方法

1.1 mtCOI基因序列下載與比對及酶切位點(diǎn)分析

從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)下載草地貪夜蛾(362條)和甜菜夜蛾(387條)、斜紋夜蛾(116條)、粘蟲(200條)的對應(yīng)mtCOI基因序列(截至2019年6月19日)，去除存在插入缺失等問題的低質(zhì)量序列，刪除兩端多余的序列，利用軟件DNAsp5分別將4種昆蟲的mtCOI序列歸為不同的單倍型并編號。利用軟件MEGA 5.05將下載整理后的序列以鄰接法(neighbor joining， NJ)建樹，各分支置信度均進(jìn)行1000次重復(fù)檢驗(yàn)，并通過分析序列間的遺傳距離確定為4種不同種的昆蟲，個體數(shù)等于序列數(shù)。將序列分析結(jié)果分別顯示為草地貪夜蛾與甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲4種昆蟲的所有mtCOI基因序列利用MAGE 5.05進(jìn)行比對分析，通過酶切位點(diǎn)匯總在線工具(http:∥www.novopro.cn/tools/rest_summary.html)對草地貪夜蛾mtCOI基因序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析，進(jìn)一步篩選可以區(qū)分草地貪夜蛾與其他3種形態(tài)相近昆蟲的酶切位點(diǎn)。

1.2 mtCOI基因序列目的片段引物設(shè)計(jì)

參照NCBI中下載整理后所分析試蟲的mtCOI基因序列，以包含Sbf I酶切位點(diǎn)的序列為模板，利用網(wǎng)站(http:∥primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)對目的片段設(shè)計(jì)引物，其中上游簡并引物為5′-ACCWTTAATATTAGGAGCYCCWGA-3′；因酶切位點(diǎn)與所分析mtCOI基因序列末端距離僅36 bp，無法設(shè)計(jì)便于實(shí)驗(yàn)和觀察結(jié)果的下游引物，因此下游引物直接利用Nagoshietal. (2017a)實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的下游引物(5′-GATGTAAAATATGCTCGTGT-3′)。擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長度為672 bp。經(jīng)PCR驗(yàn)證，此對引物可以分別對草地貪夜蛾和甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲的mtCOI基因序列進(jìn)行有效擴(kuò)增。

1.3 樣本采集及基因組DNA提取

所有樣品均采于2019年。包括草地貪夜蛾青島種群、草地貪夜蛾玉溪種群、草地貪夜蛾日照種群、甜菜夜蛾青島種群、斜紋夜蛾廣東種群、斜紋夜蛾濟(jì)南種群、粘蟲濟(jì)南種群和粘蟲青島種群共8個種群。從每個種群中隨機(jī)選取3頭，提取單頭蟲體腿部DNA。樣品DNA的提取采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，單頭蟲體腿部用液氮研磨后，按照說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作提取DNA。

1.4 目的片段的mtCOI PCR-RFLP

對mtCOI目的片段采用TaKaRa Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的體系如下(13 μL)：DNA模板2 μL，上下游引物各0.26 μL，dNTP 0.26 μL，TaKaRa Taq 酶0.13 μL，10×PCR Buffer (Mg2+)1.3 μL，ddH2O 8.79 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸7 min，共35個循環(huán)，擴(kuò)增片段為672 bp。每個個體的mtCOI基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物共24個樣本交由北京擎科生物科技有限公司測序，結(jié)果用于物種鑒定和序列分析。相關(guān)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶Sbf I進(jìn)行酶切，后使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。觀察并分析凝膠電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtCOI基因序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載于2019年6月19日前發(fā)布的草地貪夜蛾和甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲的對應(yīng)mtCOI基因序列。因草地貪夜蛾與其他3種形態(tài)相近鱗翅目昆蟲均具有部分未知序列，已知mtCOI基因序列經(jīng)對齊篩選整理后僅可保留分析538 bp，例如草地貪夜蛾mtCOI基因序列GU439148.12其中的538 bp，如下：TATTGTAACAGCCCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTTGTACCTTTAATATTAGGAGCCCTGATATAGCTTTCCCACGTATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCCCCATCTTTAACTTTATTAATTTCTAGTAGCATTGTAGAAAATGGAGCAGGAACTGGATGAACAGTTTACCCCCCCCTCTCCTCTAATATTGCTCATGGGGGTAGTTCAGTAGATTTAGCTATTTTCTCACTTCATTTAGCTGGAATTTCATCTATTTTAGGAGCTATTAACTTTATTACCACTATTATTAATATACGATTAAATAATTTATCATTTGATCAAATACCTTTATTTATTTGAGCTGTAGGTATTACCGCATTTTTATTATTATTATCTTTACCTGNTTTAGCTGGAGCTATTACTATATTACTTACTGATCGAAATCTAAATACATCATTTTTCGATCCTGCAGGAGGAGGNGATCCTATTCTTTATCAACATTTATTT。

利用軟件DNAsp5分別將4種昆蟲的mtCOI序列歸為不同的單倍型并編號，對整理后mtCOI基因序列利用軟件MEGA 5.05進(jìn)行系統(tǒng)樹發(fā)育分析判斷不同物種(圖1)，分別得到草地貪夜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲的mtCOI基因序列117、281、101、56條。

2.2 mtCOI酶切位點(diǎn)分析

通過酶切位點(diǎn)匯總在線工具(http:∥www.novopro.cn/tools/rest_summary.html)對比尋找得出:Nagoshietal. (2017a)上下游引物獲得811 bp的mtCOI片段(圖2)，所有草地貪夜蛾個體在該片段的556～561 bp處均存在Sbf I內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(表1)，因有些單倍型中所包含的mtCOI基因序列過多，此處僅列舉具有代表性的序列；其他3種形態(tài)相近昆蟲均無Sbf I酶切位點(diǎn)(圖2)。草地貪夜蛾P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)過Sbf I內(nèi)切酶酶切，可出現(xiàn)420 bp左右的特征帶；斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、粘蟲種群均不能被Sbf I內(nèi)切酶酶切。

2.3 mtCOI基因序列分析

從每種昆蟲采集樣品的每個種群中隨機(jī)選取3頭進(jìn)行mtCOI擴(kuò)增、測序，共得到24條序列，系統(tǒng)發(fā)育分析確定分別為9個草地貪夜蛾個體、3個甜菜夜蛾個體、6個斜紋夜蛾個體及6個粘蟲個體。對樣品的mtCOI基因序列對比分析發(fā)現(xiàn)，Nagoshietal. (2017a)上下游引物獲得811 bp的mtCOI片段556～561 bp處，所有草地貪夜蛾個體(9個個體)的mtCOI基因序列均存在Sbf I酶切位點(diǎn)(且561～811 bp間均不存在此酶切位點(diǎn))，其余3個物種所有個體(15個個體)在此處均無Sbf I酶切位點(diǎn)(圖2)。

2.4 基于mtCOI PCR-RFLP鑒定及分析

新設(shè)計(jì)的上游引物與下游引物結(jié)合可分別對草地貪夜蛾與甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲進(jìn)行有效擴(kuò)增(圖3)。圖4表明，將草地貪夜蛾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳，結(jié)果中出現(xiàn)一條420 bp左右的特征帶；其他3種形態(tài)相近昆蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳均不出現(xiàn)此特征帶。因此，mtCOI PCR-RFL技術(shù)可以區(qū)分草地貪夜蛾與其他3種形態(tài)相近昆蟲，若出現(xiàn)此420 bp左右的特征帶，即為草地貪夜蛾；反之，則為其他3種形態(tài)相近昆蟲。

圖1 基于mtCOI對草地貪夜蛾與其他3種形態(tài)相近昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 Sbf I酶切位點(diǎn)的分布

表1 草地貪夜蛾與其他3種形態(tài)相近昆蟲mtCOI基因序列代表Sbf I酶切位點(diǎn)

圖3 新設(shè)計(jì)上游引物位置

圖4 草地貪夜蛾與其他3種形態(tài)相近昆蟲mtCOI PCR-RFLP電泳圖譜

3 討論

草地貪夜蛾的毀滅性極強(qiáng)，是威脅世界糧食作物生產(chǎn)的跨國界遷飛性重大害蟲。因?yàn)樵撓x剛侵入我國不久，且與甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲的體長、體色、翅展長度等形態(tài)特征相近(馬麗等，2016； Yin，2010； 趙勝園等，2019)，田間為害特點(diǎn)相似(郭井菲等，2019b)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法受到蟲態(tài)等限制，很容易與這3種鱗翅目害蟲混淆，不能對其進(jìn)行準(zhǔn)確識別。因此，對草地貪夜蛾迅速準(zhǔn)確地進(jìn)行物種識別，快速鑒定當(dāng)?shù)厥欠裼胁莸刎澮苟耆肭郑菍υ撓x進(jìn)行監(jiān)測、預(yù)警和防治的關(guān)鍵，具有重要理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

目前，可應(yīng)用于物種鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)方法很多,如AFLP(楊兆富和張雅林，2005)、RAPD(Qiuetal.,2003)、SSR(丁思敏等，2018)等，但是這些技術(shù)操作復(fù)雜、成本高、速度相對較慢或其他一些因素限制其大規(guī)模應(yīng)用，而PCR-RFLP技術(shù)具有快速、靈敏、簡便、穩(wěn)定等特性(周新改等，2012)，是國內(nèi)外廣泛采用的一種快速高效物種鑒定分子生物學(xué)手段。本研究對草地貪夜蛾及其他3種形態(tài)相近鱗翅目昆蟲的mtCOI基因序列分析發(fā)現(xiàn)，所有草地貪夜蛾在556～561 bp處均存在Sbf I酶切位點(diǎn)，而其他3種害蟲均無此酶切位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)所選取的上下游引物通用性強(qiáng)，在草地貪夜蛾及甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲中均能進(jìn)行有效擴(kuò)增，利用Sbf I作為內(nèi)切酶的PCR-RFLP方法可以鑒別草地貪夜蛾與其他3種形態(tài)相近鱗翅目昆蟲。

本研究中，由于甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲mtCOI在所用片段的596 bp后未知，若在此后存在酶切位點(diǎn)，電泳結(jié)果也有可能出現(xiàn)1條>457 bp和1條<216 bp的2條帶，在進(jìn)行物種判斷的時候需要注意。此外，本研究僅對草地貪夜蛾及甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、粘蟲的mtCOI基因已知序列進(jìn)行了對比分析，如果存在其他物種，也可能影響該技術(shù)的應(yīng)用，尚需對其他物種進(jìn)行驗(yàn)證。

致謝:感謝為本研究提供斜紋夜蛾樣品的仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院申建梅博士，以及參與樣品采集的所有人員。