閆紅梅

（中海油天津化工研究設(shè)計院有限公司，天津300131）

環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水中含有大量NaCl，對生化處理干擾極大，處理難度和處理成本很高，屬于典型的高鹽度難降解工業(yè)廢水〔1〕。目前對此類高含鹽廢水的處理方法主要有物化法、生物法和物化-生化聯(lián)合法等。自然界中的耐鹽菌生活在鹽湖、鹽堿湖和海水中，耐受鹽度最高可達(dá)20%〔2〕，這些耐鹽菌的存在為高鹽廢水的生物處理提供了可能。近年來耐鹽菌已應(yīng)用于榨菜腌制廢水、高含鹽皂化廢水等高鹽廢水的處理，其中耐鹽菌的篩選成為生化處理的關(guān)鍵步驟。本研究從廢水生化處理系統(tǒng)的活性污泥中分離篩選獲取耐鹽菌，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定及生長特征考察，研究耐鹽菌在環(huán)氧樹脂廢水的降解特性，以期為此類含鹽樹脂廢水的處理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用水取自上海某化工廠環(huán)氧樹脂生產(chǎn)混合廢水，經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后稀釋，并補(bǔ)充適量營養(yǎng)物質(zhì)，其水質(zhì)如表1所示。

表1 用于耐鹽組合菌處理的廢水水質(zhì)

菌種來源：上海某化工廠及某城鎮(zhèn)污水處理廠生化處理系統(tǒng)中的活性污泥。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO40.5 g/L，NH4Cl 0.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，NaCl（5~200 g/L，按需調(diào)節(jié)），1 mL微量元素溶液。微量元素：CoCl22 g/L，NiCl2·6H2O0.05g/L，ZnCl20.05 g/L，CuCl20.03 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O2g/L，MnCl20.5g/L，EDTA1g/L，pH為7.0。

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，KH2PO42 g，NH4Cl 1 g，蒸餾水 1 000 mL，瓊脂 20 g，pH為7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐鹽菌株篩選

采用逐步提高NaCl濃度對耐鹽菌群進(jìn)行篩選培養(yǎng)。從上述2種污泥中各取2.5 g，加入滅菌的裝有100 mL無菌水的250 mL三角瓶內(nèi)，并加入質(zhì)量為無菌水0.01%的焦磷酸鈉，搖床震蕩將菌膠團(tuán)打碎。用無菌移液管吸取上述泥水混合物，在150r/min、37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h后，以10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量轉(zhuǎn)入NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)（每代3組平行實(shí)驗(yàn)，傳至10代）；直至無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%，馴化結(jié)束。將馴化得到的菌株接種至含有環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水（COD 1 000 mg/L）的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u床培養(yǎng) 72 h，得到目的菌種篩選結(jié)束〔3〕。

挑取上述分離出的單菌落，用涂布法瓊脂平板分離后，將瓊脂平板倒置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。待瓊脂平板上的菌種長成菌落后，接種保存于斜面培養(yǎng)基上富集，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用經(jīng)典分類法與16SrDNA序列分析〔4〕相結(jié)合的方法確定菌株分類種屬。對篩選后的活化菌株測序，在 Gene bank 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行BLAST比對，以獲得最相近的典型菌株16S rDNA基因序列，與數(shù)據(jù)庫中相似性高的典型菌株序列用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行對位排列，用MEGA6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌株生長曲線

用NaCl調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)基鹽度梯度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為2%、4%、6%、10%，用NaOH溶液準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH至7.0。富集后的菌株在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后分別取10 mL菌懸液接種到100 mL含不同濃度NaCl的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于37℃搖床恒溫好氧培養(yǎng)，每2 h取樣1次測定菌液OD600。

以上培養(yǎng)基及藥劑分別在121℃高壓滅菌30 min后備用。

1.2.3 耐鹽組合菌投加比的確定

用上述耐鹽菌篩選得到耐鹽菌X1、X2、X3，保持各自菌懸液的OD600在1.2左右，規(guī)定每1 mL菌懸液為1份。按正交試驗(yàn)表將菌懸液組合成所需比例，取5 mL復(fù)合菌懸液投加至50 mL廢水中，置于生物搖床中37℃培養(yǎng)24 h，測定水中COD，考察各種組合比例的廢水處理效果，以確定最佳比例。

1.2.4 投加耐鹽組合菌的生物處理

環(huán)氧樹脂生產(chǎn)混合廢水經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后，調(diào)整至適宜鹽度并補(bǔ)充適量的營養(yǎng)物質(zhì)，取處理后的廢水50 mL加入250 mL三角瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計條件分別加入耐鹽組合菌懸液，考察其對廢水COD的去除情況。

1.3 分析方法

OD600由UV-4802H紫外分光光度計測定〔尤尼柯（上海）儀器有限公司〕，CODCr按HZ-HJ-SZ-0108測定，氨氮按HJ 535—2009測定，pH測定采用pHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鹽菌株的篩選

2種混合活性污泥經(jīng)馴化篩選、富集培養(yǎng)和分離純化后，共篩選出3株耐鹽菌，分別命名為X1、X2、X3。用GenBankBlast軟件進(jìn)行序列同源性比較，3株菌株均表現(xiàn)出高度的同源性，16SrDNA序列分析為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，分別確定菌株X1 為產(chǎn)堿菌（Alcaligenes）、X2 為假單胞菌（Pseudomonas）、X3 為芽孢桿菌（Bacillus），具有耐鹽性〔5-7〕。

圖1 3株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 耐鹽菌株生長曲線

以菌液OD600為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，分別繪制3株耐鹽菌株的生長曲線，如圖2所示。

由圖2可知，X1、X2能在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~10%的NaCl環(huán)境中生長，X3可在2%~6%的NaCl環(huán)境中生長，但鹽度對菌株生長速率有很大影響。隨著鹽度的增加，菌株生長曲線的適應(yīng)期變長，對數(shù)增長期的生長速率變慢。適應(yīng)期變長的原因在于，接種到不同的鹽度環(huán)境后，微生物需經(jīng)過一定時間的調(diào)整和適應(yīng)，自身合成多種酶進(jìn)一步完善體內(nèi)的酶系統(tǒng)后，才會生長繁殖。而在高鹽環(huán)境下酶合成速度下降，產(chǎn)生新的酶系統(tǒng)需要耗費(fèi)一定時間。在對數(shù)生長期微生物雖然處于營養(yǎng)過剩狀態(tài)，但對數(shù)增長期增長速率變慢。高鹽環(huán)境下微生物在抵御外在不良環(huán)境的同時，需要耗費(fèi)大量能量調(diào)整自身的代謝途徑，或分泌胞外多聚物抵御外界不良環(huán)境因子的作用，同時需要能量合成自身生長所需物質(zhì)。這樣導(dǎo)致用于生長繁殖的能量相對減少，自身生長速率變小，世代時間變長。減速生長期歷時變長可能是由于微生物利用底物的速率下降，微生物存活率低，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)剩余〔8〕。

圖2 耐鹽菌株的生長曲線

2.3 耐鹽組合菌的生物處理

2.3.1 耐鹽組合菌投加比的確定

研究表明，利用優(yōu)勢菌株（如耐鹽菌）降解有機(jī)污染物已成為有機(jī)廢水處理的有效方法〔9〕，其中微生物菌群處理有機(jī)物的效率要高于單一菌株〔10〕。因此，對已分離出的3株耐鹽菌用正交試驗(yàn)確定X1、X2、X3組合比例，以獲得高效處理環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水的復(fù)合耐鹽菌群。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 耐鹽組合菌投加比例正交試驗(yàn)結(jié)果

由表 2 可見，最優(yōu)水平組合為 A2、B2、C3，故 3 種耐鹽菌 X1∶X2∶X3 最佳投配比為 2∶2∶3（體積比）。

2.3.2 耐鹽組合菌對Fenton預(yù)處理廢水的降解效果

實(shí)驗(yàn)固定4個因素，調(diào)整另一因素，考察廢水COD的去除效果，如表3、圖3所示。

表3 耐鹽組合菌處理廢水的影響因素組合

（1）鹽度。 由圖 3（a）可見，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%~8%時，組合耐鹽菌對廢水中有機(jī)物的降解效果在80%以上。當(dāng)NaCl為15%時，COD去除率急劇下降，這是由于隨著鹽度增加，菌株生長速率變慢，酶的合成受到限制，有機(jī)物降解速率減慢。故組合微生物最適NaCl為5%~8%。

（2）反應(yīng)時間。由圖3（b）可見，生物搖床 37℃恒溫反應(yīng)6 h，廢水COD去除率達(dá)54%，反應(yīng)12 h后去除率在70%左右，24 h后去除率上升了3%；隨著接觸時間的延長，12~48 h內(nèi)COD去除率沒有明顯變化，仍保持在80%以下。

（3）溫度。圖3（c）中廢水COD去除率隨著溫度的升高逐漸升高，在37℃時達(dá)到最大值91%左右，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時，COD去除率反而降低，主要是因?yàn)楦邷貢种莆⑸锏幕钚?，從而降低廢水COD去除率，故組合耐鹽菌降解有機(jī)物的最適溫度為37℃。

（4）pH。圖 3（d）顯示，pH 為 7 時廢水 COD 去除效果理想，COD去除率達(dá)到 85%左右；pH為 5、6時，COD去除率分別在73%、65%左右；pH為9時，COD去除率只有30%左右。因此，耐鹽組合菌在pH為7時COD去除效果最理想，pH過低或過高均會影響微生物的活性，減少有機(jī)物的降解率。

（5）投菌量。 由圖 3（e）可見，廢水 COD 去除率隨投菌量的增加而不斷增加，投菌量為5%時COD去除率比3%時的去除率明顯提高；菌體投加量為5%、10%時，COD去除率分別為80%、94%。投菌量為12%時COD去除率為98%，但相對于10%的降解率增幅有限，故選擇最佳投菌量為10%。

綜上所述，在適合耐鹽菌生長環(huán)境下，用其處理Fenton預(yù)處理后的廢水，COD去除率維持在70%~80%。通過單因素試驗(yàn)確定最佳實(shí)驗(yàn)條件：廢水pH為7，反應(yīng)時間為24 h，反應(yīng)溫度37℃，廢水中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~8%，耐鹽組合菌最佳投加量為廢水體積的10%。

圖3 不同影響因素對COD去除效果的影響

3 結(jié)論

（1）對環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)及城鎮(zhèn)污水處理生化池中的活性污泥進(jìn)行馴化，篩選出3株能高效降解廢水COD又可在高鹽度環(huán)境中生長良好的耐鹽菌，命名為X1、X2、X3。采用16SrDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定，分離篩選得到3株耐鹽菌株分別為X1屬產(chǎn)堿菌（Alcaligenes）、X2屬假單胞菌（Pseudomonas）、X3 屬芽孢桿菌（Bacillus）。

（2）通過正交試驗(yàn)確定3株菌株組合最佳投配比為 2∶2∶3（體積比），用該組合菌處理 Fenton 預(yù)處理后鹽度為5%~8%的廢水，耐鹽組合菌最佳投加量為廢水體積的10%，在pH為7、37℃下?lián)u床反應(yīng)時間24 h，能保持較高的COD去除率。