程燦燦，朱劍霞，古裕蓮，陳順儀，張金枚

(1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 511400； 2.江門市中心醫(yī)院中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院產(chǎn)科，廣東 江門 529000)

引起泌尿生殖道感染的常見支原體有脲原體、人型支原體以及生殖支原體。脲原體屬有Parvo和T960兩個(gè)生物型，其是兩個(gè)獨(dú)立的種。具有Parvo生物群特征的脲原體又被稱為微小脲原體(Ureaplasma parvum，Up)，而有T960生物群特征的支原體被稱為解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，Uu)[1]。在臨床工作中，常規(guī)支原體培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)尚不能區(qū)分Uu和Up[2]，本研究收集的脲原體包括這兩個(gè)種。由于脲原體結(jié)構(gòu)和代謝上的特殊性，導(dǎo)致用于臨床治療的抗菌藥物有限，目前主要有喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物。近年來支原體的耐藥呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，其對(duì)喹類藥物的敏感性顯著降低，耐藥現(xiàn)象尤為嚴(yán)重[3]。研究顯示，喹諾酮耐藥決定區(qū)域(quinolone resistance determining regions，QRDRs)基因突變與脲原體對(duì)該類藥物的耐藥相關(guān)[4]。本研究針對(duì)性地檢測(cè)脲原體gyrA、gyrB、parC、parE基因中QRDRs的突變情況，初步探討泌尿生殖道脲原體對(duì)喹諾酮類的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1菌株來源 選擇2017年2月在廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院就診的556例泌尿生殖道感染患者為樣本來源，患者年齡16～64歲，平均(33±8)歲，無其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病。由接診醫(yī)師進(jìn)行標(biāo)本采集。男性清洗及消毒尿道口后，用尿道拭子插入患者尿道口2～4 cm處輕旋1周，停留片刻后取出；女性清洗及消毒外陰后，用拭子插入患者宮頸口1～2 cm處輕旋1周，停留片刻后取出。標(biāo)本無菌密封并立即送檢。

1.1.2主要儀器和試劑 Veriti FAST 96-WELL型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)；Gel Doc XR+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；Taq DNA聚合酶(批號(hào)：AH0645A)、DNA Marker 2000(批號(hào)：A2201C)均購自TaKaRa公司[日本寶生物工程(大連)有限公司]；DNA提取液購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司(批號(hào)：2017001)；支原體培養(yǎng)、鑒定、藥物敏感一體化試劑盒購自珠海麗珠生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：2016119809)；引物合成及測(cè)序服務(wù)均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1支原體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照支原體培養(yǎng)、鑒定、藥物敏感一體化試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)本的接種、鑒定及藥物敏感結(jié)果判定。具體操作為：溶解培養(yǎng)小瓶中的培養(yǎng)基后，取50 μL培養(yǎng)基加入C-空白孔中，然后將無菌拭子采集的樣本插入培養(yǎng)基中，擠壓旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，棄拭子，將混勻的液體培養(yǎng)基分別加入試劑條所有鑒定及藥敏孔中(除C-外)。最后在每一孔中滴加一滴無菌液體石蠟并密封。將含有剩余培養(yǎng)基的培養(yǎng)小瓶與試劑條一起置于35 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48 h后觀察鑒定及藥敏結(jié)果。其中，試劑條喹諾酮類藥物的藥敏孔為氧氟沙星(4 mg/L和8 mg/L)、左氧氟沙星(2 mg/L和8 mg/L)和司帕沙星(1 mg/L 和4 mg/L)，3種藥物分別設(shè)置高、低兩個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)置1孔。在檢驗(yàn)結(jié)果鑒定為脲原體陽性的標(biāo)本中，對(duì)應(yīng)藥物的兩個(gè)濃度藥敏孔均不變色提示對(duì)該藥物敏感，對(duì)應(yīng)藥物的兩個(gè)濃度藥敏孔均變?yōu)榧t色提示對(duì)藥物高度耐藥，低濃度孔變紅色、高濃度孔不變色提示低度耐藥。從中篩選出對(duì)喹諾類藥物低度耐藥和高度耐藥的脲原體陽性的培養(yǎng)基(菌液)，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2脲原體DNA提取 選取7株有代表性的菌株(對(duì)至少1種喹諾酮類藥物高度耐藥)提取DNA并進(jìn)行基因擴(kuò)增和測(cè)序。取上述保存?zhèn)溆玫木暌后w培養(yǎng)物400 μL，12 879×g離心5 min后棄上清，加滅菌的0.9%氯化鈉溶液1 mL,充分混勻后12 879×g離心5 min并棄上清液；沉淀物中加入50 μL DNA提取液，充分混勻后100 ℃溫浴10 min，冷卻后12 879×g離心5 min，取上清液備用。

1.2.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序 以提取的脲原體DNA為模板，PCR擴(kuò)增gyrA、gyrB、parC、parE基因。所涉及的引物序列[5]見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，退火30 s(各片段退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行純化測(cè)序。

表1 引物列表

1.3觀察指標(biāo) 根據(jù)鑒定及藥敏結(jié)果分析脲原體感染和耐藥情況。對(duì)測(cè)序基因進(jìn)行序列分析，參照已報(bào)道的脲原體標(biāo)準(zhǔn)株Up ATCC 27815(GenBank序列號(hào)：CP000942)[6]和Uu ATCC 33699(GenBank序列號(hào)：CP001184)[7]的gyrA、gyrB、parC、parE基因分析并確定耐藥菌株的QRDRs序列的突變情況，并進(jìn)行氨基酸預(yù)測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1引起泌尿生殖道感染的支原體菌株分布及藥敏結(jié)果 本研究共有556份標(biāo)本送檢，其中支原體陽性標(biāo)本314例，單純脲原體感染246例。支原體陽性率達(dá)44.2%(246/556)。菌株藥敏試驗(yàn)顯示，43例對(duì)3種喹諾酮類藥物均敏感，占17.5%；38例對(duì)至少1種藥物高度耐藥，占15.4%。對(duì)氧氟沙星高度耐藥的菌株有36例，占14.6%，對(duì)司帕沙星敏感的菌株有88例，占35.8%，見表2。

表2 246例單純脲原體感染病例對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥情況

2.27株菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果及分析 PCR擴(kuò)增7株菌株的gyrA、gyrB、parC、parE基因片段，經(jīng)電泳檢測(cè)在250～500 bp有一明亮清晰條帶，與目標(biāo)片段大小一致，見圖1。

M：marker 2000；1-7泳道分別為1-7號(hào)標(biāo)本對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖1 gyrA、gyrB、parC、parE基因片段電泳圖

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化測(cè)序，得到的DNA序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 27815)相應(yīng)的基因序列進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，7株菌株的gyrA和gyrB片段與Up ATCC 27815的相應(yīng)基因序列相似度為100%，而與Uu ATCC 33699的相應(yīng)基因序列相似度則較低，7株菌株可能均為Up而非Uu。耐藥菌株的parC和parE片段與ATCC 27815的相應(yīng)基因序列比較，7株耐藥菌株的parC均可見C248T突變，parE均可見T1473C突變。見表3。在這些突變點(diǎn)中，只有C248T為非同義突變，造成parC的第83位氨基酸由絲氨酸變?yōu)榱涟彼?S83L)，其余突變位點(diǎn)均為同義突變，未導(dǎo)致氨基酸改變。

3 討 論

因脲原體無細(xì)胞壁，所以對(duì)作用于微生物細(xì)胞壁的抗菌藥物如β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等天然抵抗；又由于其生長(zhǎng)繁殖過程不合成葉酸，因此對(duì)磺胺類及甲氧芐啶也不敏感；此外，對(duì)氨基糖苷類、多黏菌素、利福平等也高度耐藥。泌尿生殖道支原體感染

表3 7株耐藥菌株parC和parE基因的變異情況

治療首選大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類以及四環(huán)素類藥物。喹諾酮類是一類人工合成的廣譜抗生素，對(duì)脲原體有較好的抗菌活性，可口服用藥，因不良反應(yīng)少而被廣泛應(yīng)用。本地區(qū)之前的研究顯示，脲原體對(duì)喹諾酮類藥物(氧氟沙星、左氧氟沙星和司帕沙星)的全敏感率為12.24%[8]，本研究結(jié)果(17.5%)與此接近。脲原體對(duì)喹諾酮藥物不同程度的耐藥在本地區(qū)及其他地區(qū)已相當(dāng)嚴(yán)重，因此探討耐藥機(jī)制十分必要。

喹諾酮類藥物是通過抑制Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶活性(包括旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ)，阻止細(xì)菌DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致細(xì)菌不能正常繁殖傳代。旋轉(zhuǎn)酶是由gyrA和gyrB基因編碼，而拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是由parC和parE編碼。這4個(gè)基因的突變均可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象的改變，進(jìn)而導(dǎo)致藥物不能與靶酶結(jié)合而產(chǎn)生耐藥。本研究選取的是對(duì)至少1種喹諾酮類藥物高度耐藥的菌株。這7株菌的旋轉(zhuǎn)酶基因gyrA、garB的保守性較高，在所測(cè)序列位置未發(fā)現(xiàn)堿基突變。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ基因的突變較多。與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27815序列進(jìn)行比較，parC基因C248T(S83L)突變模式在7株菌中均存在。有文獻(xiàn)報(bào)道，C248T是否發(fā)生與喹諾酮類藥物敏感性密切相關(guān)[9-10]。近年來，這一突變?cè)谂R床分離的耐喹諾酮的Up與Uu中被頻繁檢出，成為中國地區(qū)QRDRs最普遍的突變[7]。S83L在parC上的突變?cè)谌蚋鞯仡l繁出現(xiàn)，歐洲[11]、北美[4]、亞洲等地都有報(bào)道。Kawai等[10]采用軟件對(duì)S83L和S83W進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)突變的氨基酸位點(diǎn)均可通過位阻作用干擾菌株與喹諾酮類藥物的結(jié)合，但在體外實(shí)驗(yàn)中并未觀察到該突變直接導(dǎo)致脲原體耐藥的證據(jù)。S83L和S83W形成的耐藥性可針對(duì)氧氟沙星、左氧氟沙星和司帕沙星3種喹諾酮類藥物。雖然該突變與喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制相關(guān)，但這7株帶有相同耐藥突變位點(diǎn)的菌株對(duì)這3種喹諾酮類藥物的敏感性不完全相同，提示極有可能存在其他的耐藥機(jī)制。有報(bào)道指出，脲原體細(xì)胞膜通透性的改變可能是耐氟喹諾酮類機(jī)制其中之一[12]。

本研究結(jié)果顯示，parC、parE基因存在較多的同義突變位點(diǎn)。parC基因的突變G270C、T408C和parE基因的突變T1473C在本研究中也較普遍，但未發(fā)生氨基酸突變，可能是基因的多態(tài)性位點(diǎn)。對(duì)于gyrA基因，最常見的非同義突變是L176F，其次是Up中的 F67I、K78I、G179D、S174R，以及Uu中的 D77V[3]。研究顯示，與喹諾酮相關(guān)的parC和gyrA突變類型可能存在地區(qū)差異[13]。因此，有必要進(jìn)行大樣本耐藥基因的調(diào)查分析，了解本地區(qū)脲原體QRDRs突變特點(diǎn)，以明確本地區(qū)脲原體對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制。

7株臨床株經(jīng)擴(kuò)增后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，gyrA、gyrB、parC和parE基因與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列比較，提示屬于Up的可能較大。目前，Uu和Up的劃分主要依據(jù)基因組之間的差異，核酸檢測(cè)能進(jìn)行區(qū)分[14]，但尚未應(yīng)用于臨床診斷。文獻(xiàn)報(bào)道，Up的檢出率明顯高于Uu，甚至健康體檢人群也攜帶Up[15]，但截至目前尚不能證明哪一種脲原體的致病性更強(qiáng)。在女性下生殖道標(biāo)本中脲原體的定植較常見，因此臨床工作中Uu及Up的區(qū)分也十分必要。但在對(duì)喹諾酮藥物如氧氟沙星、左氧氟沙星的體外敏感性上，Uu及Up的差異并不大[16-17]，parC基因的C248T突變?cè)斐傻陌被酳83L改變?cè)趦煞N脲原體中均有檢出，并未發(fā)現(xiàn)在哪一種脲原體中獨(dú)立存在。許多研究致力于脲原體耐藥機(jī)制的探索，但其耐藥機(jī)制復(fù)雜，目前尚無確定的單一耐藥機(jī)制。目前認(rèn)為主要是gyrA、gyrB、parC以及parE基因的突變導(dǎo)致脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物不敏感[18]，但有報(bào)道顯示形成生物被膜與喹諾酮類藥物敏感性降低有關(guān)[19-20]。有專家研究了基于脲原體管家基因(ftsH、rpL22、valS、thrS)的多位點(diǎn)序列分型方案，試圖通過研究脲原體的不同克隆群特點(diǎn)分析多位點(diǎn)序列分析與脲原體藥物敏感性的關(guān)系[21]。

綜上所述，喹諾酮類藥物對(duì)本地區(qū)的脲原體存在較低的體外敏感性，并檢測(cè)到脲原體存在與喹諾酮耐藥相關(guān)的基因突變，即parC基因C248T(S83L)突變。由于本研究的限制及現(xiàn)有的耐藥機(jī)制研究并不能完全解釋脲原體臨床分離株對(duì)喹諾酮的耐藥機(jī)制，因此持續(xù)監(jiān)測(cè)解脲脲原體喹諾酮類藥物的耐藥情況并進(jìn)一步探討脲原體喹諾酮耐藥機(jī)制十分必要。