王克芬,佟新偉,張 杰,王興吉,劉文龍

(山東隆科特酶制劑有限公司,山東省酶制劑發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 臨沂 276400)

果膠酶是能分解植物組織中果膠質(zhì)的酶類(lèi)物質(zhì),廣泛分布于微生物和高等植物中,在一些昆蟲(chóng)和原生動(dòng)物體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)[1-3]。1972年,研究者首次從噬堿菌中分離出堿性果膠酶。據(jù)報(bào)道，由微生物生產(chǎn)的果膠酶占全球食品用酶的25%,已成為一種十分重要的生物酶制劑[4-6]。果膠酶主要包括原果膠酶、果膠醋酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶等四大類(lèi)[7-10]。來(lái)源于微生物的原果膠酶、果膠醋酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶的最適pH有偏酸的、偏堿的,而果膠酸裂解酶則全部屬于堿性果膠酶[11-14]。真菌來(lái)源的果膠酶較細(xì)菌來(lái)源的偏酸[15-16]。堿性果膠酶的作用原理是通過(guò)反式消去作用切斷植物纖維上果膠酸及果膠酸酯分子中的α-1,4-糖苷鍵[17]。

果膠酶的生產(chǎn)菌株有很多,應(yīng)用較多的是真菌,以曲霉屬菌較為常見(jiàn)。真菌產(chǎn)的果膠酶大部分是酸性果膠酶,這類(lèi)真菌主要是曲霉屬、青霉屬、鐮孢屬、毛霉屬、酵母屬。細(xì)菌產(chǎn)的果膠酶以堿性果膠酶為主,這類(lèi)細(xì)菌主要是假單抱菌屬、黃單孢菌屬、歐文氏菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌等[18]。

酸性果膠酶主要應(yīng)用于果汁和蔬菜產(chǎn)業(yè)、釀酒業(yè),堿性果膠酶在麻類(lèi)的生物脫膠、棉織物的精練、造紙、動(dòng)物飼料、果膠廢水預(yù)處理、咖啡發(fā)酵和茶發(fā)酵等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[19-20]。堿性果膠酶在紡織行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景,主要用于苧麻脫膠和棉織物前處理的精煉環(huán)節(jié)中,與高溫堿煮方法相比,具有保護(hù)纖維、降低能耗、沒(méi)有化學(xué)污染等優(yōu)勢(shì)[21-22]。

產(chǎn)堿性果膠酶的菌株的培養(yǎng)基由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等組成。本實(shí)驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性果膠酶,對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在提高該菌株的發(fā)酵水平,降低生產(chǎn)成本,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及擴(kuò)大生產(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌: 實(shí)驗(yàn)室篩選出保存的菌種。

1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、瓊脂18 g/L、pH為7.0。

搖瓶種子培養(yǎng)基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、pH為7.0。

種子罐培養(yǎng)基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、pH為7.0。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基:35 g/L棉籽蛋白、30 g/L麥芽糖漿、20 g/L果膠、pH為7.0。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子的活化

將凍存種子在平板培養(yǎng)基上畫(huà)線分離,在36 ℃條件下培養(yǎng)36 h,選取活化好的單菌落于裝在200 mL搖瓶中的種子培養(yǎng)基上,在36 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 種子罐的培養(yǎng)

以5%的接種量轉(zhuǎn)接到10 L種子罐培養(yǎng)基中,在36 ℃、罐壓0.05 MPa條件下,通過(guò)增加轉(zhuǎn)速和風(fēng)量控制溶氧50%以上,補(bǔ)氨控制PH7.0,培養(yǎng)11 h。

1.3.3 發(fā)酵罐的培養(yǎng)

以5%的接種量接到含30L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,在36 ℃、罐壓0.05 MPa條件下,通過(guò)增加轉(zhuǎn)速和風(fēng)量控制溶氧30%40%,補(bǔ)氨控制PH7.0,培養(yǎng)52 h。

1.4 堿性果膠酶活力測(cè)定

將發(fā)酵液在4 ℃條件下,在12 000 r/min的高速冷凍離心機(jī)上離心5 min,取上清液制成酶液測(cè)定酶活力。方法如下。

取1 mL酶液和2 mL果膠1%(w/v)果膠(PH9.0緩沖液配制)溶液分別置于兩個(gè)試管中,于45 ℃水浴預(yù)熱5 min,再將它們充分混合,準(zhǔn)確反應(yīng)10 min,取上述混合物1 mL加入9 mL 0.01 mol/L HCL終止反應(yīng),在235 nm處測(cè)定吸光值,以滅過(guò)酶活的酶液作為空白對(duì)照。

將1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位定義為每分鐘裂解果膠產(chǎn)生1 umol不飽和聚半乳糖酸酸的酶量。不飽和聚半乳糖酸酸在235 nm處的摩爾吸光系數(shù)為4 600 mol/(L·cm)。

酶活力:U=(A/4600)×106×10-3×3×10×10-1×n=A×n×30/46

上式中，U為酶液的酶活力,單位為U/mL;A為OD235;n為酶液稀釋倍數(shù)。

1.5 總糖測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過(guò)程如下:取6支25 mL刻度試管,編號(hào)后按順序分別加入0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 μg/mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液,再分別加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的水。接著按順序加入1 mL 9%的苯酚溶液,搖勻。最后加入濃硫酸5 mL,混均后靜置冷卻,以試劑空白液為對(duì)照,用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處,1 cm比色皿測(cè)定吸光度值。

以蔗糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示。

圖1 總糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品總糖測(cè)定過(guò)程如下:取一定稀釋倍數(shù)(稀釋100或200倍)的樣品液2 mL,步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的相同,按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液,顯色并測(cè)定光密度。用標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出總糖的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化

利用20 L發(fā)酵罐，對(duì)枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)堿性果膠酶培養(yǎng)基中的發(fā)酵主料種類(lèi)及配比進(jìn)行優(yōu)化研究。

2.1.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的30 g/L麥芽糖漿分別用30 g/L的乳糖、蔗糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉替換。測(cè)定發(fā)酵液上清堿性果膠酶酶活，結(jié)果如表1所示。

表1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳源種類(lèi)對(duì)產(chǎn)酶的影響較大,其中馬鈴薯淀粉的產(chǎn)酶效果最好,其次是玉米淀粉、麥芽糖漿、蔗糖、乳糖。馬鈴薯淀粉促進(jìn)菌體產(chǎn)生較高酶活,原因可能是馬鈴薯淀粉含有多種本菌株所需要的營(yíng)養(yǎng)成分,促進(jìn)了堿性果膠酶的生成。因此,選擇馬鈴薯淀粉作為培養(yǎng)基碳源。

以馬鈴薯淀粉為作為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源,對(duì)不同濃度的馬鈴薯淀粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將馬鈴薯淀粉質(zhì)量濃度按梯度設(shè)為20、25、30、35、40、45 g/L,其他成分不變,結(jié)果如表2所示。

表2 馬鈴薯淀粉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

馬鈴薯淀粉濃度為35 g/L時(shí)相對(duì)酶活最高。馬鈴薯淀粉濃度對(duì)產(chǎn)酶有很大影響:若濃度過(guò)低則導(dǎo)致不能滿(mǎn)足菌體代謝需求,進(jìn)而影響產(chǎn)酶;濃度過(guò)高則提高發(fā)酵液的滲透壓,就會(huì)使細(xì)胞脫水,導(dǎo)致細(xì)胞受損或死亡,形成代謝阻遏,抑制酶的表達(dá)。選擇濃度為35 g/L的馬鈴薯淀粉進(jìn)行氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的35 g/L棉籽蛋白分別用35 g/L硝酸鈉、硫酸銨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、玉米漿、豆餅粉替換。結(jié)果如表3所示。

表3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

無(wú)機(jī)氮源與有機(jī)氮源對(duì)酶表達(dá)影響的區(qū)別很大。無(wú)機(jī)氮源不但未促進(jìn)產(chǎn)酶反而降低酶活水平,有機(jī)氮源對(duì)酶的影響較大,在使用豆餅粉時(shí)能促進(jìn)產(chǎn)酶。對(duì)不同質(zhì)量濃度的豆餅粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以酶活的百分比表示酶活的含量,最大酶活為100%,結(jié)果如表4所示。

表4 豆餅粉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

豆餅粉的濃度為30 g/L,其相對(duì)酶活高于其他質(zhì)量濃度,表明此濃度利于產(chǎn)酶,因此選取30 g/L豆餅粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

在優(yōu)化碳氮源的基礎(chǔ)上添加無(wú)機(jī)鹽，研究微生物對(duì)產(chǎn)酶的影響,分別添加20 mmol/L的ZnSO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、FeSO4于優(yōu)化培養(yǎng)基中,結(jié)果如表5所示。

表5 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

從表中可以看到對(duì)酶的表達(dá)影響最大的是CaCl2，其次是ZnSO4。這兩種鹽的促進(jìn)作用較一致,因此在培養(yǎng)基中都添加相同的摩爾比例,考察這兩種鹽對(duì)酶表達(dá)的影響,結(jié)果如表6所示。

表6 不同濃度Ca2+和Zn2+對(duì)產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，25 mmol/L的Ca2+和Zn2+對(duì)酶活的影響較大,均高于對(duì)照組,這表明添加Ca2+或Zn2+對(duì)酶的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用,因此添加25 mmol/L(即4.025 g/L)的ZnSO4和2.775 g/L的CaCl2于優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

磷是菌體生長(zhǎng)繁殖所需的重要元素,在發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽對(duì)pH值起到緩沖作用,避免pH值短時(shí)間內(nèi)迅速改變,在上述優(yōu)化配方的基礎(chǔ)上添加0.6 mol/L磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響,結(jié)果如表7所示。

表7 磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表7可以看出,添加Na2HPO4可以有效提高酶活,并且可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)。進(jìn)一步對(duì)不同濃度的Na2HPO4進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以酶活的百分比來(lái)表示酶活的含量,最大酶活為100%,結(jié)果如表8所示。

表8 磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,濃度為0.8 mol/L(即113.6 g/L)的Na2HPO4可以進(jìn)一步提高酶活水平。在優(yōu)化配方后,進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵過(guò)程的控制方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

溫度在發(fā)酵過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用,影響著微生物的整個(gè)代謝過(guò)程。分別設(shè)置34、35、36、37、38 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表9所示。

表9 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

從表9可知,溫度在35 ℃時(shí)酶活最大,溫度低于35 ℃時(shí)酶活較低,而高于35 ℃時(shí)酶活梯度下降。當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)菌體代謝較慢,所產(chǎn)酶量也較少；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)菌體代謝所需酶的活性降低，導(dǎo)致發(fā)酵減緩,從而影響酶的表達(dá)。

2.2.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種量不同也會(huì)影響菌體代謝。分別設(shè)定1%、3%、5%、7%、9%的接種量,測(cè)定酶活，比較產(chǎn)酶效果,結(jié)果如表10所示。

表10 接種量對(duì)酶活的影響

從表中可知,接種量為3%對(duì)酶活的影響較大。接種量的大小影響發(fā)酵過(guò)程酶的表達(dá)：接種量小導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢降低酶的發(fā)酵水平；接種量較大，前期菌體生長(zhǎng)迅速,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗,并產(chǎn)生大量代謝廢物及有毒物質(zhì),抑制中后期微生物生長(zhǎng)。因此,選取接種量為3%。

2.2.3 發(fā)酵過(guò)程pH優(yōu)化

pH對(duì)菌體發(fā)酵培養(yǎng)及酶的表達(dá)有至關(guān)重要的影響。通過(guò)補(bǔ)加磷酸和氨水來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程中的pH,測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的酶活水平,結(jié)果如表11所示。

表11 發(fā)酵罐中不同pH對(duì)酶活的影響

當(dāng)pH=7.4時(shí)對(duì)產(chǎn)酶更有利。因此在后續(xù)的補(bǔ)料過(guò)程中控制pH=7.4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 發(fā)酵罐補(bǔ)料優(yōu)化

碳源在菌體發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。不斷補(bǔ)充碳源可以為菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶提供能量,以延長(zhǎng)產(chǎn)酶周期。因此，實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中不斷流加350 g/L濃度的不同碳源,以維持發(fā)酵液中的總糖濃度為20 μg/mL,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表12所示。

表12 補(bǔ)料對(duì)產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)表明，流加350 g/L濃度的葡萄糖對(duì)菌體產(chǎn)酶有非常明顯的促進(jìn)作用。

2.2.5 發(fā)酵罐補(bǔ)料配方的優(yōu)化

果膠物質(zhì)在菌體發(fā)酵過(guò)程中起著產(chǎn)酶促進(jìn)劑的作用,不斷補(bǔ)充碳源可以為菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶提供能量。隨著酶活水平不斷提高,果膠物質(zhì)大量消耗,會(huì)導(dǎo)致此類(lèi)誘導(dǎo)物質(zhì)的含量不足,因此在補(bǔ)料配方中添加不同濃度的果膠以觀察其對(duì)酶活的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表13所示。

實(shí)驗(yàn)表明,補(bǔ)料配方中添加10 g/L的果膠會(huì)誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生更多的堿性果膠酶,達(dá)到更高的酶活水平。使用以上優(yōu)化的配方及控制工藝后,發(fā)酵罐的產(chǎn)酶曲線與之前的產(chǎn)酶曲線如圖2所示。

表13 補(bǔ)料對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 發(fā)酵前后的產(chǎn)酶曲線

3 結(jié)論

對(duì)本公司所儲(chǔ)藏的枯草芽孢桿菌進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)堿性果膠酶的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),最終確定了枯草芽孢桿菌的最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:馬鈴薯淀粉35 g/L、豆餅粉30 g/L、氯化鈣2.775 g/L、硫酸鋅4.025 g/L、Na2HPO4113.6 g/L、果膠20 g/L。最優(yōu)發(fā)酵控制工藝:發(fā)酵溫度為35 ℃,接種量為3%。在發(fā)酵過(guò)程中控制PH值為7.4,維持罐壓0.05 MPa以提高供氧能力,通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)速和風(fēng)量,使發(fā)酵罐中的溶氧水平維持在30%～40%。為進(jìn)一步提高酶活水平,采用連續(xù)補(bǔ)料的方式,優(yōu)化后的補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為:葡萄糖350 g/L、果膠10 g/L。通過(guò)補(bǔ)料控制總糖濃度為20 μg/mL,發(fā)酵產(chǎn)酶周期為52 h左右。經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化后,最終酶活達(dá)到6120 U/mL,較初始配方的酶活1061 U/mL提高了4.77倍。

本實(shí)驗(yàn)存在很多不足。例如,在補(bǔ)料過(guò)程中僅補(bǔ)加單一的碳源,營(yíng)養(yǎng)成分較單一,產(chǎn)酶量相對(duì)較低。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將考慮配合添加部分氮源或磷酸鹽等,以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量。利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性果膠酶,具有發(fā)酵周期短、安全性好、酶活高等優(yōu)點(diǎn),對(duì)本出發(fā)菌株進(jìn)行物理和化學(xué)誘變處理,能夠進(jìn)一步提高酶活。