王克芬,佟新偉,張 杰,王興吉,劉文龍

(山東隆科特酶制劑有限公司,山東省酶制劑發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 臨沂 276400)

果膠酶是能分解植物組織中果膠質(zhì)的酶類物質(zhì),廣泛分布于微生物和高等植物中,在一些昆蟲和原生動物體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)[1-3]。1972年,研究者首次從噬堿菌中分離出堿性果膠酶。據(jù)報(bào)道，由微生物生產(chǎn)的果膠酶占全球食品用酶的25%,已成為一種十分重要的生物酶制劑[4-6]。果膠酶主要包括原果膠酶、果膠醋酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶等四大類[7-10]。來源于微生物的原果膠酶、果膠醋酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶的最適pH有偏酸的、偏堿的,而果膠酸裂解酶則全部屬于堿性果膠酶[11-14]。真菌來源的果膠酶較細(xì)菌來源的偏酸[15-16]。堿性果膠酶的作用原理是通過反式消去作用切斷植物纖維上果膠酸及果膠酸酯分子中的α-1,4-糖苷鍵[17]。

果膠酶的生產(chǎn)菌株有很多,應(yīng)用較多的是真菌,以曲霉屬菌較為常見。真菌產(chǎn)的果膠酶大部分是酸性果膠酶,這類真菌主要是曲霉屬、青霉屬、鐮孢屬、毛霉屬、酵母屬。細(xì)菌產(chǎn)的果膠酶以堿性果膠酶為主,這類細(xì)菌主要是假單抱菌屬、黃單孢菌屬、歐文氏菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌等[18]。

酸性果膠酶主要應(yīng)用于果汁和蔬菜產(chǎn)業(yè)、釀酒業(yè),堿性果膠酶在麻類的生物脫膠、棉織物的精練、造紙、動物飼料、果膠廢水預(yù)處理、咖啡發(fā)酵和茶發(fā)酵等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[19-20]。堿性果膠酶在紡織行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景,主要用于苧麻脫膠和棉織物前處理的精煉環(huán)節(jié)中,與高溫堿煮方法相比,具有保護(hù)纖維、降低能耗、沒有化學(xué)污染等優(yōu)勢[21-22]。

產(chǎn)堿性果膠酶的菌株的培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機(jī)鹽等組成。本實(shí)驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性果膠酶,對其發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在提高該菌株的發(fā)酵水平,降低生產(chǎn)成本,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及擴(kuò)大生產(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌: 實(shí)驗(yàn)室篩選出保存的菌種。

1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、瓊脂18 g/L、pH為7.0。

搖瓶種子培養(yǎng)基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、pH為7.0。

種子罐培養(yǎng)基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、pH為7.0。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基:35 g/L棉籽蛋白、30 g/L麥芽糖漿、20 g/L果膠、pH為7.0。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子的活化

將凍存種子在平板培養(yǎng)基上畫線分離,在36 ℃條件下培養(yǎng)36 h,選取活化好的單菌落于裝在200 mL搖瓶中的種子培養(yǎng)基上,在36 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 種子罐的培養(yǎng)

以5%的接種量轉(zhuǎn)接到10 L種子罐培養(yǎng)基中,在36 ℃、罐壓0.05 MPa條件下,通過增加轉(zhuǎn)速和風(fēng)量控制溶氧50%以上,補(bǔ)氨控制PH7.0,培養(yǎng)11 h。

1.3.3 發(fā)酵罐的培養(yǎng)

以5%的接種量接到含30L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,在36 ℃、罐壓0.05 MPa條件下,通過增加轉(zhuǎn)速和風(fēng)量控制溶氧30%40%,補(bǔ)氨控制PH7.0,培養(yǎng)52 h。

1.4 堿性果膠酶活力測定

將發(fā)酵液在4 ℃條件下,在12 000 r/min的高速冷凍離心機(jī)上離心5 min,取上清液制成酶液測定酶活力。方法如下。

取1 mL酶液和2 mL果膠1%(w/v)果膠(PH9.0緩沖液配制)溶液分別置于兩個試管中,于45 ℃水浴預(yù)熱5 min,再將它們充分混合,準(zhǔn)確反應(yīng)10 min,取上述混合物1 mL加入9 mL 0.01 mol/L HCL終止反應(yīng),在235 nm處測定吸光值,以滅過酶活的酶液作為空白對照。

將1個標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位定義為每分鐘裂解果膠產(chǎn)生1 umol不飽和聚半乳糖酸酸的酶量。不飽和聚半乳糖酸酸在235 nm處的摩爾吸光系數(shù)為4 600 mol/(L·cm)。

酶活力:U=(A/4600)×106×10-3×3×10×10-1×n=A×n×30/46

上式中，U為酶液的酶活力,單位為U/mL;A為OD235;n為酶液稀釋倍數(shù)。

1.5 總糖測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過程如下:取6支25 mL刻度試管,編號后按順序分別加入0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 μg/mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液,再分別加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的水。接著按順序加入1 mL 9%的苯酚溶液,搖勻。最后加入濃硫酸5 mL,混均后靜置冷卻,以試劑空白液為對照,用分光光度計(jì)在485 nm波長處,1 cm比色皿測定吸光度值。

以蔗糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示。

圖1 總糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品總糖測定過程如下:取一定稀釋倍數(shù)(稀釋100或200倍)的樣品液2 mL,步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的相同,按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液,顯色并測定光密度。用標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出總糖的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化

利用20 L發(fā)酵罐，對枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)堿性果膠酶培養(yǎng)基中的發(fā)酵主料種類及配比進(jìn)行優(yōu)化研究。

2.1.1 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的30 g/L麥芽糖漿分別用30 g/L的乳糖、蔗糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉替換。測定發(fā)酵液上清堿性果膠酶酶活，結(jié)果如表1所示。

表1 碳源對產(chǎn)酶的影響

碳源種類對產(chǎn)酶的影響較大,其中馬鈴薯淀粉的產(chǎn)酶效果最好,其次是玉米淀粉、麥芽糖漿、蔗糖、乳糖。馬鈴薯淀粉促進(jìn)菌體產(chǎn)生較高酶活,原因可能是馬鈴薯淀粉含有多種本菌株所需要的營養(yǎng)成分,促進(jìn)了堿性果膠酶的生成。因此,選擇馬鈴薯淀粉作為培養(yǎng)基碳源。

以馬鈴薯淀粉為作為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源,對不同濃度的馬鈴薯淀粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將馬鈴薯淀粉質(zhì)量濃度按梯度設(shè)為20、25、30、35、40、45 g/L,其他成分不變,結(jié)果如表2所示。

表2 馬鈴薯淀粉濃度對產(chǎn)酶的影響

馬鈴薯淀粉濃度為35 g/L時相對酶活最高。馬鈴薯淀粉濃度對產(chǎn)酶有很大影響:若濃度過低則導(dǎo)致不能滿足菌體代謝需求,進(jìn)而影響產(chǎn)酶;濃度過高則提高發(fā)酵液的滲透壓,就會使細(xì)胞脫水,導(dǎo)致細(xì)胞受損或死亡,形成代謝阻遏,抑制酶的表達(dá)。選擇濃度為35 g/L的馬鈴薯淀粉進(jìn)行氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的35 g/L棉籽蛋白分別用35 g/L硝酸鈉、硫酸銨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、玉米漿、豆餅粉替換。結(jié)果如表3所示。

表3 氮源對產(chǎn)酶的影響

無機(jī)氮源與有機(jī)氮源對酶表達(dá)影響的區(qū)別很大。無機(jī)氮源不但未促進(jìn)產(chǎn)酶反而降低酶活水平,有機(jī)氮源對酶的影響較大,在使用豆餅粉時能促進(jìn)產(chǎn)酶。對不同質(zhì)量濃度的豆餅粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以酶活的百分比表示酶活的含量,最大酶活為100%,結(jié)果如表4所示。

表4 豆餅粉濃度對產(chǎn)酶的影響

豆餅粉的濃度為30 g/L,其相對酶活高于其他質(zhì)量濃度,表明此濃度利于產(chǎn)酶,因此選取30 g/L豆餅粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.1.3 無機(jī)鹽對產(chǎn)酶的影響

在優(yōu)化碳氮源的基礎(chǔ)上添加無機(jī)鹽，研究微生物對產(chǎn)酶的影響,分別添加20 mmol/L的ZnSO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、FeSO4于優(yōu)化培養(yǎng)基中,結(jié)果如表5所示。

表5 金屬離子對產(chǎn)酶的影響

從表中可以看到對酶的表達(dá)影響最大的是CaCl2，其次是ZnSO4。這兩種鹽的促進(jìn)作用較一致,因此在培養(yǎng)基中都添加相同的摩爾比例,考察這兩種鹽對酶表達(dá)的影響,結(jié)果如表6所示。

表6 不同濃度Ca2+和Zn2+對產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，25 mmol/L的Ca2+和Zn2+對酶活的影響較大,均高于對照組,這表明添加Ca2+或Zn2+對酶的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用,因此添加25 mmol/L(即4.025 g/L)的ZnSO4和2.775 g/L的CaCl2于優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 磷酸鹽對產(chǎn)酶的影響

磷是菌體生長繁殖所需的重要元素,在發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽對pH值起到緩沖作用,避免pH值短時間內(nèi)迅速改變,在上述優(yōu)化配方的基礎(chǔ)上添加0.6 mol/L磷酸鹽對產(chǎn)酶的影響,結(jié)果如表7所示。

表7 磷酸鹽對產(chǎn)酶的影響

由表7可以看出,添加Na2HPO4可以有效提高酶活,并且可以促進(jìn)菌體的生長。進(jìn)一步對不同濃度的Na2HPO4進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以酶活的百分比來表示酶活的含量,最大酶活為100%,結(jié)果如表8所示。

表8 磷酸鹽對產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,濃度為0.8 mol/L(即113.6 g/L)的Na2HPO4可以進(jìn)一步提高酶活水平。在優(yōu)化配方后,進(jìn)一步對發(fā)酵過程的控制方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對產(chǎn)酶的影響

溫度在發(fā)酵過程中起著非常關(guān)鍵的作用,影響著微生物的整個代謝過程。分別設(shè)置34、35、36、37、38 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表9所示。

表9 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

從表9可知,溫度在35 ℃時酶活最大,溫度低于35 ℃時酶活較低,而高于35 ℃時酶活梯度下降。當(dāng)溫度過低時菌體代謝較慢,所產(chǎn)酶量也較少；當(dāng)溫度過高時菌體代謝所需酶的活性降低，導(dǎo)致發(fā)酵減緩,從而影響酶的表達(dá)。

2.2.2 接種量對產(chǎn)酶的影響

接種量不同也會影響菌體代謝。分別設(shè)定1%、3%、5%、7%、9%的接種量,測定酶活，比較產(chǎn)酶效果,結(jié)果如表10所示。

表10 接種量對酶活的影響

從表中可知,接種量為3%對酶活的影響較大。接種量的大小影響發(fā)酵過程酶的表達(dá)：接種量小導(dǎo)致菌體生長緩慢降低酶的發(fā)酵水平；接種量較大，前期菌體生長迅速,營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗,并產(chǎn)生大量代謝廢物及有毒物質(zhì),抑制中后期微生物生長。因此,選取接種量為3%。

2.2.3 發(fā)酵過程pH優(yōu)化

pH對菌體發(fā)酵培養(yǎng)及酶的表達(dá)有至關(guān)重要的影響。通過補(bǔ)加磷酸和氨水來控制發(fā)酵過程中的pH,測定發(fā)酵過程中的酶活水平,結(jié)果如表11所示。

表11 發(fā)酵罐中不同pH對酶活的影響

當(dāng)pH=7.4時對產(chǎn)酶更有利。因此在后續(xù)的補(bǔ)料過程中控制pH=7.4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 發(fā)酵罐補(bǔ)料優(yōu)化

碳源在菌體發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用。不斷補(bǔ)充碳源可以為菌體的生長和產(chǎn)酶提供能量,以延長產(chǎn)酶周期。因此，實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中不斷流加350 g/L濃度的不同碳源,以維持發(fā)酵液中的總糖濃度為20 μg/mL,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表12所示。

表12 補(bǔ)料對產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)表明，流加350 g/L濃度的葡萄糖對菌體產(chǎn)酶有非常明顯的促進(jìn)作用。

2.2.5 發(fā)酵罐補(bǔ)料配方的優(yōu)化

果膠物質(zhì)在菌體發(fā)酵過程中起著產(chǎn)酶促進(jìn)劑的作用,不斷補(bǔ)充碳源可以為菌體的生長和產(chǎn)酶提供能量。隨著酶活水平不斷提高,果膠物質(zhì)大量消耗,會導(dǎo)致此類誘導(dǎo)物質(zhì)的含量不足,因此在補(bǔ)料配方中添加不同濃度的果膠以觀察其對酶活的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表13所示。

實(shí)驗(yàn)表明,補(bǔ)料配方中添加10 g/L的果膠會誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生更多的堿性果膠酶,達(dá)到更高的酶活水平。使用以上優(yōu)化的配方及控制工藝后,發(fā)酵罐的產(chǎn)酶曲線與之前的產(chǎn)酶曲線如圖2所示。

表13 補(bǔ)料對產(chǎn)酶的影響

圖2 發(fā)酵前后的產(chǎn)酶曲線

3 結(jié)論

對本公司所儲藏的枯草芽孢桿菌進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)堿性果膠酶的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),最終確定了枯草芽孢桿菌的最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:馬鈴薯淀粉35 g/L、豆餅粉30 g/L、氯化鈣2.775 g/L、硫酸鋅4.025 g/L、Na2HPO4113.6 g/L、果膠20 g/L。最優(yōu)發(fā)酵控制工藝:發(fā)酵溫度為35 ℃,接種量為3%。在發(fā)酵過程中控制PH值為7.4,維持罐壓0.05 MPa以提高供氧能力,通過調(diào)整轉(zhuǎn)速和風(fēng)量,使發(fā)酵罐中的溶氧水平維持在30%～40%。為進(jìn)一步提高酶活水平,采用連續(xù)補(bǔ)料的方式,優(yōu)化后的補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為:葡萄糖350 g/L、果膠10 g/L。通過補(bǔ)料控制總糖濃度為20 μg/mL,發(fā)酵產(chǎn)酶周期為52 h左右。經(jīng)過上述優(yōu)化后,最終酶活達(dá)到6120 U/mL,較初始配方的酶活1061 U/mL提高了4.77倍。

本實(shí)驗(yàn)存在很多不足。例如,在補(bǔ)料過程中僅補(bǔ)加單一的碳源,營養(yǎng)成分較單一,產(chǎn)酶量相對較低。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將考慮配合添加部分氮源或磷酸鹽等,以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量。利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性果膠酶,具有發(fā)酵周期短、安全性好、酶活高等優(yōu)點(diǎn),對本出發(fā)菌株進(jìn)行物理和化學(xué)誘變處理,能夠進(jìn)一步提高酶活。