劉 程，何韻秋，徐寧寧，葉均安

（浙江大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，浙江杭州310058）

泌乳中后期奶牛奶產(chǎn)量以每月6%～7% 的速度下降，減緩奶產(chǎn)量下降速度、提高泌乳持續(xù)力成為泌乳中后期奶牛飼養(yǎng)管理中的關(guān)鍵任務(wù)[1]。泌乳中后期奶牛奶產(chǎn)量下降受到生理和營(yíng)養(yǎng)兩方面因素的影響，因此通過(guò)提高日糧養(yǎng)分利用率來(lái)保證能量和蛋白供給成為維持泌乳中后期奶牛奶產(chǎn)量的重要途經(jīng)[2]。反芻動(dòng)物瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)和少量噬菌體[3]。在瘤胃微生物中細(xì)菌種類(lèi)最多、最復(fù)雜，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和代謝密切相關(guān)[4]，因此分析瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)和多樣性變化對(duì)研究不同因素的作用機(jī)理有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加益生菌能夠顯著提高纖維降解菌數(shù)量，進(jìn)而提高干物質(zhì)（DM）和中性洗滌纖維（NDF）降解率，提高生產(chǎn)性能[5-6]。由于不同菌屬益生菌之間存在協(xié)同作用，研究熱點(diǎn)已逐漸從添加單一益生菌向復(fù)合益生菌方向發(fā)展[7]。目前，研究多集中在探究復(fù)合益生菌對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和瘤胃發(fā)酵的影響[8-9]，對(duì)于其作用機(jī)理的研究較少。本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛瘤胃菌群進(jìn)行分析，探究復(fù)合益生菌如何通過(guò)影響瘤胃菌群結(jié)構(gòu)來(lái)提高奶牛生產(chǎn)性能，為拓寬復(fù)合益生菌在反芻動(dòng)物上的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 復(fù)合益生菌購(gòu)自杭州利牧源科技有限公司，含地衣芽孢桿菌（活菌數(shù)≥1.0×109CFU/g）、枯草芽孢桿菌（活菌數(shù)≥2.0×109CFU/g）和米曲霉（活菌數(shù)≥ 2.0×104CFU/g）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取健康泌乳中后期荷斯坦奶牛20 頭，按照奶產(chǎn)量（21.3±4.4）kg/d、泌乳天數(shù)（211±36.3）d和胎次（1.9±0.7）相近原則，隨機(jī)分為2 組，每組10頭奶牛。對(duì)照組飼喂全混合日糧（TMR），試驗(yàn)組在TMR 中每天每頭牛添加復(fù)合益生菌20 g，預(yù)試期添加量減半。

1.3 飼養(yǎng)管理與日糧組成 飼養(yǎng)試驗(yàn)于2018 年7 月17日—8 月30 日在浙江省寧波市荷優(yōu)牧業(yè)有限公司進(jìn)行，試驗(yàn)期45 d，預(yù)試期7 d。奶牛采用栓系式飼養(yǎng)，自由采食和飲水。每天于06:00 和18:00 喂料，各組TMR飼喂量基本一致；試驗(yàn)組復(fù)合益生菌按早、晚各半拌入TMR 中。TMR 組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 TMR 組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 奶產(chǎn)量 試驗(yàn)開(kāi)始前連續(xù)3 d 測(cè)定每頭牛的奶產(chǎn)量記作初始奶產(chǎn)量，試驗(yàn)期每隔7 d 測(cè)定1 次奶產(chǎn)量。每隔15 d 采集早、晚乳樣，按照50:50 比例混勻，裝入50 mL 含有萬(wàn)分之六重鉻酸鉀的離心管，送上海市DHI 檢測(cè)中心檢測(cè)乳成分。4%乳脂矯正乳和能量校正乳計(jì)算公式如下：

4%乳脂校正乳（kg/d）=0.4×奶產(chǎn)量（kg/d）+15×乳脂率×奶產(chǎn)量（kg/d）

能量校正乳（kg/d）=奶產(chǎn)量（kg/d）×[（0.0929×乳脂率）+（0.0563×乳蛋白率）+（0.0395×乳糖率）]÷0.749

1.4.2 采食量 試驗(yàn)結(jié)束前3 d，連續(xù)記錄投料量與剩料量，計(jì)算采食量。

1.4.3 表觀消化率 對(duì)照組與試驗(yàn)組分別隨機(jī)選取8 頭試驗(yàn)牛，于飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束前3 d 直腸取糞，通過(guò)內(nèi)源指示劑法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。計(jì)算公式：

飼料某養(yǎng)分消化率=100 － 100×（飼料中AIA 含量/ 糞中AIA 含量）×（糞中某養(yǎng)分含量/ 飼料中某養(yǎng)分含量）

式中，AIA 為酸不溶灰分。

1.4.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù) 選擇直腸取糞的試驗(yàn)牛，于試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天口腔采集瘤胃液，立即測(cè)定pH，然后-20℃保存。通過(guò)氣相色譜儀測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量，考馬斯亮藍(lán)法和比色法分別測(cè)定微生物蛋白（MCP）和氨態(tài)氮（NH3-N）濃度。另取50 mL 瘤胃液于-80℃保存，用于DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增。

DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增：采用CTAB 的方法[10]提取樣品DNA，利用NanoDrop2000 進(jìn)行DNA 濃度和純度的檢測(cè)。用無(wú)菌水將提取DNA 稀釋至1 ng/μL，用V4 區(qū)引物 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 30 μL：Phusion Master Mix（2×）15 μL；引物（2 μmol/L）3 μL；DNA（1 ng/μL）10 μL；去離子水2 μL。PCR 反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性1 min；進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)包括 98 ℃變性 10 s；50 ℃退火 30 s；72℃延伸30 s；最后72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒（Thermofisher）進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用IonS5TMXL（Thermofisher）進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序公司為北京諾和致源科技股份有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用 Cutadapt（V1.9.1）先對(duì) reads 進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切，再根據(jù)Barcode 從得到的reads 中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)。利用 Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）以 97% 的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs（Operational Taxonomic Units）。 用 Mothur 方 法 與 SILVA132（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），獲得分類(lèi)學(xué)信息并分別在各個(gè)分類(lèi)水平（界、門(mén)、綱、目、科、屬、種）上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao1、ACE、Shannon、Simpson 指數(shù)，Unifrac 距離，使用R 軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線，WGCNA，stats 和 ggplot2 軟件包進(jìn)行 PCoA 分析。Anosim 分析使用R vegan 包anosim 函數(shù)，基于Bray-Curtis 距離值的秩次進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。

奶產(chǎn)量、乳成分、表觀消化率、發(fā)酵參數(shù)、α多樣性等數(shù)據(jù)采用Excel 2013 進(jìn)行整理，應(yīng)用SAS 9.2 軟件Proc mixed 模型進(jìn)行方差分析，Tukey 進(jìn)行多重比較分析，其中P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)奶產(chǎn)量、乳成分和干物質(zhì)采食量的影響 如圖1 所示，2 組奶牛奶產(chǎn)量整體呈下降趨勢(shì)，但試驗(yàn)組下降幅度顯著低于對(duì)照組。方差分析結(jié)果顯示（表2），試驗(yàn)組奶產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組，但是2 組間4%乳脂校正乳（4%FCM）、能量校正乳（ECM）和干物質(zhì)采食量均無(wú)顯著差異。由表3 可知，試驗(yàn)組的乳蛋白和總固形物產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組，其他指標(biāo)無(wú)顯著差異。

圖1 泌乳中后期奶牛奶產(chǎn)量變化曲線

表2 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛干物質(zhì)采食量、奶產(chǎn)量的影響 kg/d

2.2 復(fù)合益生菌對(duì)表觀消化率的影響 由表4 可知，試驗(yàn)組粗蛋白質(zhì)（CP）表觀消化率顯著高于對(duì)照組，而DM、粗脂肪（EE）、NDF 和酸性洗滌纖維（ADF）表觀消化率在2 組間無(wú)差異。

2.3 復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表5 可知，試驗(yàn)組奶牛瘤胃MCP 濃度顯著高于對(duì)照組，但是瘤胃pH、VFA 和NH3-N 濃度在2 組間無(wú)顯著差異。

2.4 復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌菌落組成的影響

表3 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛乳成分的影響

表4 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響 %

表5 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.4.1 復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性的影響 過(guò)濾掉低質(zhì)量堿基序列后2 組樣本共得到1 373 913 條記錄，過(guò)濾掉嵌合體后用于分析的優(yōu)質(zhì)序列共有1 288 680 條，序列平均長(zhǎng)度為414.8。從圖2 可以看出，在當(dāng)前測(cè)序深度下，各樣品基于OTU 水平的稀釋曲線趨于平緩，說(shuō)明本試驗(yàn)測(cè)序數(shù)量合理，能夠進(jìn)行后續(xù)分析。將序列以97% 的一致性進(jìn)行OTUs 聚類(lèi)，共得到2 286 個(gè)OTUs，其中2 組共有OTUs 共計(jì)1 939 個(gè)，占總OTUs數(shù)目的84.82%；差異OTUs 中對(duì)照組有192 個(gè)，試驗(yàn)組有155 個(gè)（圖3）。由表6 可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組Chao1 和ACE 指數(shù)無(wú)顯著差異，說(shuō)明復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群的豐富度無(wú)顯著影響；Shannon 和Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異，說(shuō)明復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群的多樣性無(wú)顯著影響。

圖2 樣品稀釋曲線

圖3 OTU 韋恩圖

表6 復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

2.4.2 復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)的影響 在門(mén)水平上（表7），復(fù)合益生菌對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度無(wú)顯著影響；但是在屬水平上（表8），試驗(yàn)組的琥珀酸菌屬相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，琥珀酸弧菌屬顯著低于對(duì)照組，瘤胃球菌屬有升高的趨勢(shì)（P=0.06）。

2.4.3 聚類(lèi)分析通過(guò)Unweighted Unifrac 主成分分析可以看出（圖4），2 組樣品能較好地分開(kāi)，PC1 解釋28.36% 的差異，PC2 解釋14.3% 的差異。但是聚類(lèi)樹(shù)分析不能將對(duì)照組和試驗(yàn)組有效區(qū)分（圖5）。Anosim分析表明本試驗(yàn)中組間差異大于組內(nèi)差異（R=0.12），但2 組間不存在顯著差異。

表7 復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度（門(mén)水平）的影響（top10） %

表8 復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度（屬水平）的影響（top10） %

3 討 論

圖4 PCoA 分析

圖5 UPGMA 聚類(lèi)樹(shù)分析

3.1 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛泌乳性能的影響 益生菌能夠通過(guò)提高瘤胃微生物活動(dòng)促進(jìn)日糧瘤胃降解，為泌乳提供充足的代謝能和代謝蛋白。夏天嬋等[11]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加由酵母培養(yǎng)物和芽孢桿菌等組成的復(fù)合益生菌能夠使泌乳中后期奶牛奶產(chǎn)量提高5.3%，顯著提高乳蛋白率、乳糖率和總固形物，且顯著提高瘤胃中MCP 含量。本試驗(yàn)中，復(fù)合益生菌同樣顯著提高了泌乳中后期奶牛奶產(chǎn)量、乳蛋白和總固形物產(chǎn)量。Tricarico 等[8]研究表明，添加米曲霉提取物可顯著提高泌乳中期奶牛乳脂校正乳和能量校正乳產(chǎn)量，乳蛋白產(chǎn)量也呈上升趨勢(shì)。丁洪濤等[9]研究表明，枯草芽孢桿菌能促使瘤胃發(fā)酵類(lèi)型向丙酸型轉(zhuǎn)變，提高日糧利用率，促進(jìn)瘤胃纖維降解。黃帥等[12]研究表明，米曲霉顯著提高了日糧DM、CP、ADF 和NDF 的瘤胃降解率。本試驗(yàn)中奶產(chǎn)量提升可能是復(fù)合益生菌促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵，提高了飼料轉(zhuǎn)化效率，為泌乳提供更多的能量和蛋白供給。乳蛋白產(chǎn)量提高可能與復(fù)合益生菌促進(jìn)瘤胃微生物生成量，提高了代謝蛋白供給有關(guān)。

3.2 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛飼料表觀消化率的影響 瘤胃是反芻動(dòng)物主要的消化器官，絕大部分的碳水化合物和蛋白質(zhì)在瘤胃被降解，尤其是纖維的降解完全依賴(lài)于瘤胃微生物分泌的纖維降解酶。益生菌能夠調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵，并且有些益生菌還能夠分泌外源降解酶，提高日糧降解率。付曉政等[13]研究發(fā)現(xiàn)，由乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌等組成復(fù)合益生菌飼喂泌乳中期的荷斯坦奶牛能夠顯著提高CP 和EE 的表觀消化率。Francia等[14]報(bào)道，米曲霉能夠通過(guò)改善瘤胃降解纖維的效率增加對(duì)飼料的消化能力，產(chǎn)生的酶可以促進(jìn)纖維分解菌將纖維轉(zhuǎn)化為單糖。鄧露芳[15]研究發(fā)現(xiàn)，用納豆芽孢桿菌飼喂泌乳中期的瘺管荷斯坦奶牛24 h 后，瘤胃中淀粉分解菌和蛋白分解菌的數(shù)量分別提高11.8% 和16.2%。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組CP 的表觀消化率較對(duì)照組顯著提高，一方面可能是復(fù)合益生菌改變了瘤胃微生物菌群的結(jié)構(gòu)和組成，蛋白分解菌屬（如普雷沃菌屬比例）增加，另一方面可能受益生菌分泌外源酶的影響。

3.3 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 瘤胃pH 是衡量瘤胃發(fā)酵情況的直觀指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃pH 無(wú)顯著影響，但試驗(yàn)組瘤胃pH 略低于對(duì)照組，其原因可能與試驗(yàn)組的TVFA 生成量高于對(duì)照組有關(guān)。瘤胃VFA 是反芻動(dòng)物主要能量來(lái)源。Rosenberger 等[16]認(rèn)為，當(dāng)瘤胃VFA 濃度在60～120 mmol/L時(shí)，反芻動(dòng)物能夠維持正常的生長(zhǎng)代謝。本試驗(yàn)中VFA濃度處于較合理的區(qū)間范圍。丁洪濤等[9]通過(guò)體外發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌提高VFA 產(chǎn)量，降低乙酸/丙酸。本試驗(yàn)中雖然TVFA 濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但試驗(yàn)組比對(duì)照組提高了7.63%，說(shuō)明復(fù)合益生菌能夠促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵，為動(dòng)物生產(chǎn)提供更多能量。

飼料中的部分蛋白質(zhì)進(jìn)入瘤胃后被分解生成NH3-N，然后被微生物利用合成MCP。Sun 等[17]在利用米曲霉體外發(fā)酵中國(guó)野生黑麥和玉米青貯的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，米曲霉能夠極顯著提高不同飼料來(lái)源瘤胃液中的MCP 濃度。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合益生菌顯著提高瘤胃液MCP 濃度。一方面可能是復(fù)合益生菌刺激瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生更多的NH3-N，促進(jìn)了微生物合成MCP；另一方面芽孢桿菌通過(guò)生物奪氧效應(yīng)消耗隨飼料進(jìn)入瘤胃的氧氣，維持厭氧環(huán)境，有利于瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和MCP 的合成。

3.4 復(fù)合益生菌對(duì)泌乳中后期奶牛瘤胃細(xì)菌組成的影響本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)探究復(fù)合益生菌對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)的影響。根據(jù)α分析的結(jié)果，添加復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌的豐富度和多樣性無(wú)顯著影響。對(duì)照組和試驗(yàn)組中擬桿菌門(mén)均為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，厚壁菌門(mén)為第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這與Jami 等[18]對(duì)荷斯坦奶牛瘤胃細(xì)菌組成的高通量測(cè)序結(jié)果一致。擬桿菌門(mén)在瘤胃中的主要作用是分解蛋白質(zhì)和碳水化合物，其中普雷沃氏菌屬、毛螺菌屬、擬桿菌屬在蛋白質(zhì)降解、肽的吸收利用中起重要作用[19]，試驗(yàn)組中這3 個(gè)菌屬的相對(duì)豐度高于對(duì)照組可能是CP 降解率提高的原因之一。雖然對(duì)照組和試驗(yàn)組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度沒(méi)有顯著差異，但試驗(yàn)組的擬桿菌門(mén)中普雷沃菌屬比對(duì)照組高38%，同時(shí)琥珀酸菌屬的豐度也顯著高于對(duì)照組，普雷沃菌屬能夠分解淀粉和蛋白質(zhì)產(chǎn)生琥珀酸和乙酸[19-20]，琥珀酸菌屬能夠利用琥珀酸生成丙酸[21]。因此，復(fù)合益生菌可以通過(guò)促進(jìn)普雷沃菌屬和琥珀酸菌屬的增殖提高丙酸產(chǎn)量，改變瘤胃發(fā)酵模式。

厚壁菌門(mén)的主要功能是促進(jìn)纖維物質(zhì)的消化吸收[22]。瘤胃球菌屬屬于厚壁菌門(mén)，能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶降解植物纖維；琥珀酸菌屬是纖維降解菌屬，其中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌具有很強(qiáng)的纖維分解活性，能夠降解瘤胃球菌屬中黃白瘤胃球菌不能降解的纖維素[23]。因此，試驗(yàn)組中高相對(duì)豐度的瘤胃球菌屬和琥珀酸菌屬在一定程度上引起NDF 表觀消化率的提高。

4 結(jié) 論

復(fù)合益生菌對(duì)瘤胃細(xì)菌的豐富度和多樣性無(wú)顯著影響，但是可以提高瘤胃球菌屬和琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度，改善瘤胃發(fā)酵，提高瘤胃液微生物蛋白合成，促進(jìn)粗蛋白和纖維降解，進(jìn)而提高奶產(chǎn)量。