高 霖，劉 犇,2*，彭瑞妮,2，章志濤,2，張雯苑，李國生，梅 婷，鄒劍偉,2

（1.宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，肉牛羊疾病控制實驗室，江西宜春 336000；2.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西宜春 336000）

隨著集約化畜牧業(yè)的發(fā)展[1]、引種和屠宰需求增加，動物往往需要經(jīng)歷運輸[2]，運輸使動物暴露于一系列不良刺激之下，會引起機體發(fā)生多種生理和生化反應(yīng)，如躁動不安、呼吸與心跳加速，機體內(nèi)營養(yǎng)、水分大量消耗，同時影響動物的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能，免疫力降低，導致發(fā)病甚至死亡[3-5]。隨著國內(nèi)外畜禽貿(mào)易的發(fā)展，動物調(diào)運日益頻繁，運輸應(yīng)激造成的經(jīng)濟損失也越來越大，已經(jīng)成為我國畜牧業(yè)快速發(fā)展的重要制約因素[6]。

小腸同時具有消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)和免疫屏障功能。因此，小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細胞的數(shù)量變化可以很好地反映腸道黏膜免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)及小腸的局部免疫狀態(tài)[7-8]。以往國內(nèi)外對動物小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細胞的研究較多[9-11]，但在運輸應(yīng)激對小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細胞的影響方面研究較少。本研究旨在分析短時間和長時間2 種不同運輸應(yīng)激對山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)和淋巴細胞、杯狀細胞、肥大細胞數(shù)量及分布的影響，為深入研究畜禽運輸應(yīng)激發(fā)病機理及解決方案提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 在江西當?shù)厣窖蝠B(yǎng)殖場選擇精神狀態(tài)與健康狀況良好、體況相近、體重為（13.89±2.96）kg 且經(jīng)布魯氏菌病檢測為陰性的贛西公山羊18 頭。

1.2 試驗設(shè)計 將18 頭山羊隨機平均分成3 組，即對照組、2 h 運輸處理組和6 h 運輸處理組。裝載前在正常條件下飼養(yǎng)山羊，對照組山羊不做處理；運輸處理組山羊人工保定好裝載到運輸車輛上，裝載密度為1.5 m2/只，于06:00—12:00 進行運輸應(yīng)激處理。運輸應(yīng)激處理時天氣晴好、車內(nèi)溫度約25～30℃，且山羊在運輸時禁食禁水，以35～45 km/h 的速度進行公路運輸。然后分別在運輸應(yīng)激處理2 h（08:00）和6 h（12:00）后抓羊并卸載，對山羊使用速眠新肌肉注射麻醉，屠宰后分別取十二指腸、空腸、回腸中段各約5 cm，用4℃ PBS 洗凈后迅速放入4%多聚甲醛中用于后續(xù)常規(guī)染色和組織化學染色分析。

1.3 檢測指標和方法 將各腸段組織石蠟包埋制備連續(xù)切片，每隔10 張選取1 張。每只山羊隨機選擇5 張切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）、甲苯胺藍-高錳酸鉀（MTB）以及過碘酸-雪夫氏（PAS）染色后，在光學顯微鏡下進行觀察。在每張切片中隨機選擇5 根典型腸絨毛，運用圖像分析軟件對絨毛高度和隱窩深度進行測量，然后計算絨毛高度/隱窩深度的比值（絨腺比）；分別在各腸段的每張切片中隨機選取5 根柱狀細胞排列整齊、完整性較好的典型腸絨毛，在光學顯微鏡下計算所選每根腸絨毛中的肥大細胞數(shù)量，計算所選每根腸絨毛中分布的上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計分析 用SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。若F 檢驗結(jié)果顯著則再用LSD 法進行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 運輸應(yīng)激對山羊十二指腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細胞數(shù)量的影響 由表1 及圖1 可知，對照組及各運輸處理組間十二指腸絨毛高度均無顯著變化；與對照組相比，2 個運輸處理組隱窩深度均極顯著增大，6 h 運輸處理組也極顯著大于2 h 運輸處理組；對照組、2 h 和6 h 運輸處理組絨腺比依次減小，3 組間差異極顯著。對照組、2 h 和6 h 運輸處理組上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量依次增加，3 組間差異極顯著；與對照組相比，2 個運輸處理組肥大細胞數(shù)量均極顯著增加，其中6 h 運輸處理組極顯著少于2 h 運輸處理組。

2.2 運輸應(yīng)激對山羊空腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細胞數(shù)量的影響 由圖2、表1 可知，與對照組相比，運輸處理組絨毛高度均極顯著減小，但2 個運輸處理組間差異不顯著；與對照組相比，6 h 運輸處理組隱窩深度極顯著增大，2 h 運輸處理組無顯著變化；對照組、2 h 運輸處理組和6 h 運輸處理組的絨腺比依次減小，3 組間差異極顯著。對照組、2 h 運輸處理組和6 h 運輸處理組上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量依次增加，3 組間差異極顯著；與對照組相比，2 個運輸處理組肥大細胞數(shù)量均極顯著增加，但2 個運輸處理組之間差異不顯著。

2.3 運輸應(yīng)激對山羊回腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細胞數(shù)量的影響 由圖3、表1 可知，運輸處理組絨毛高度與對照組相比變化均不顯著，但2 h 運輸處理組顯著大于6 h運輸處理組；與對照組相比，2 h 運輸處理組隱窩深度極顯著增大，6 h 運輸處理組隱窩深度顯著減小；與對照組相比，2 h 運輸處理組絨腺比極顯著減小，6 h 運輸處理組極顯著增大。對照組、2h 和6h 運輸處理組上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量依次增加，3 組間差異極顯著；與對照組相比，2 個運輸處理組肥大細胞數(shù)量均極顯著升高，其中6 h 運輸處理組顯著低于2h 運輸處理組。

表1 山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細胞檢測結(jié)果

3 討 論

小腸是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，正常的小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)是保證機體充分消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)。小腸絨毛是小腸黏膜的主要結(jié)構(gòu)，是動物營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的特有結(jié)構(gòu)，因此小腸絨毛高度和絨腺比是評價小腸發(fā)育和消化吸收功能的重要指標[12-13]。腸絨毛高時，成熟的絨毛細胞多，營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力強；腸隱窩深度體現(xiàn)了腸腺細胞的生成率，隱窩變淺，說明細胞成熟率升高，分泌能力強[14]。因此，當絨腺比增大時，小腸絨毛吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力增強，反則亦然[15-16]。本研究結(jié)果表明，除6 h 運輸處理組山羊回腸絨腺比極顯著大于對照組外，2 個運輸處理組山羊其他各腸段絨腺比均極顯著小于對照組；除2 h 運輸處理組空腸及6 h 運輸處理組回腸外，與對照組相比，運輸處理組山羊其他各腸段腸隱窩深度均極顯著增加；運輸處理組山羊各腸段腸絨毛高度與對照組相比也均有一定變化。這些變化說明運輸應(yīng)激對山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)造成了一定的損傷，使小腸的消化吸收能力下降。多項研究表明，肉牛經(jīng)長途運輸后，體重均有一定的降低，運輸后約2 周才逐漸恢復至運輸前狀態(tài)[17-18]，這也佐證了運輸應(yīng)激使小腸黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致小腸消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力降低，最后可能間接引起動物體重下降。

圖1 各組山羊十二指腸淋巴細胞、杯狀細胞和肥大細胞（400×）

圖2 各組山羊空腸淋巴細胞、杯狀細胞和肥大細胞（400×）

圖3 各組山羊回腸淋巴細胞、杯狀細胞和肥大細胞（400×）

小腸黏膜不僅具有吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能，還能應(yīng)對致病性抗原入侵和不良因素刺激，進而使機體保持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，維持機體正常生命活動的免疫屏障功能[19-21]。小腸黏膜免疫系統(tǒng)由分布在小腸黏膜內(nèi)的淋巴組織和免疫活性細胞共同組成，構(gòu)成了抵抗病原體入侵的第一道免疫屏障，黏膜的免疫狀況是小腸能否抵抗外來病原感染和入侵的關(guān)鍵因素。小腸黏膜內(nèi)免疫活性細胞的數(shù)量和分布情況與小腸黏膜的免疫狀況密切相關(guān)[22]。小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞是小腸黏膜免疫系統(tǒng)的效應(yīng)部分之一[23-24]，也是機體小腸黏膜免疫系統(tǒng)中和外來抗原及微生物接觸最早的免疫細胞。因此，小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量和分布情況可以較好地反映小腸局部黏膜的免疫狀況。本研究結(jié)果表明，運輸處理組山羊各腸段腸絨毛上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)較對照組均極顯著增加，提示運輸應(yīng)激對山羊小腸黏膜免疫系統(tǒng)有較強的免疫激活作用，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，以此抵抗運輸應(yīng)激時細菌、病毒以及寄生蟲等的侵襲[23]。

杯狀細胞是專門合成、分泌黏蛋白的分泌型腸上皮細胞，其分泌的黏蛋白與水和無機鹽等共同構(gòu)成覆蓋于腸道表面的黏液系統(tǒng)[25-27]。黏液系統(tǒng)在腸黏膜上皮表面形成屏障，對上皮有保護和潤滑的作用，同時對食物消化率的提高較為重要[8]。還有研究認為，在尚未建立起被動免疫的初生動物的腸道免疫中，杯狀細胞起著更為重要的防御作用[28]。杯狀細胞曾被認為只是一種單純的分泌細胞[29]，但最近有研究觀察到，杯狀細胞可以通過形成杯狀細胞相關(guān)抗原通道將抗原轉(zhuǎn)移到固有層內(nèi)的抗原遞呈細胞[30]。本研究表明，運輸處理組山羊各腸段腸絨毛上皮內(nèi)杯狀細胞數(shù)較對照組均極顯著增加，提示運輸應(yīng)激一定程度上損傷了山羊小腸黏膜，導致機體可能通過增加小腸絨毛內(nèi)杯狀細胞數(shù)量及其分泌黏蛋白含量，來抵御病原微生物的侵襲以及有害物質(zhì)對小腸上皮的損害。

肥大細胞通過其分泌的細胞因子和炎癥介質(zhì)不僅能介導速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，還在先天性免疫以及獲得性免疫中起著重要作用。研究表明，肥大細胞能通過表達CD40、CD40L 促進抗原遞呈細胞、T 細胞、B 細胞的活化，還能通過表達和分泌一系列免疫相關(guān)分子、細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用[31]。本研究結(jié)果顯示，運輸處理組山羊各腸段腸絨毛肥大細胞數(shù)相比于對照組均有極顯著增加，提示在運輸應(yīng)激條件下肥大細胞被激活，可能發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，短時間和長時間的運輸應(yīng)激均對山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)造成了較大損傷，且運輸后山羊小腸上皮內(nèi)淋巴細胞、杯狀細胞和肥大細胞數(shù)量顯著增加，表明運輸應(yīng)激顯著影響了山羊小腸的局部免疫狀態(tài)，小腸黏膜免疫系統(tǒng)被激活，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和免疫屏障作用。