賈小舟，張子?xùn)|，何建鑫，匡海學(xué)，王秋紅*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)應(yīng)用與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006)

知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)為百合科知母的干燥根莖[1]。于春季和秋季采挖，除去其根須和表面附著泥沙，后曬干，習(xí)稱“毛知母”[2]；或除其外皮并曬干[3]。其味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱瀉火、生津潤燥的功效[4]，主要用于治療外感熱病，內(nèi)熱消渴，骨蒸潮熱，肺熱燥咳，高熱煩渴，腸燥便秘等癥[5]。知母作為臨床常用藥材歷史悠久，是常用中藥復(fù)方的組成部分，其活性成分主要包含有甾體皂苷類[6-7]、雙苯吡酮類[8]、黃酮類、有機(jī)酸類、木脂素類、多糖類和微量元素等[9]。知母皂苷類成分以甾體皂苷的數(shù)量最多，含量最高，而知母中含有最多的成分為多糖組分，是知母的重要物質(zhì)組成[10]。以往對(duì)知母的研究大多關(guān)注知母原藥材的小分子，近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)知母活性成分之一——糖類化合物進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)知母多糖具有明顯的降血糖作用、抗炎作用和抗氧化的功能[11-12]?，F(xiàn)通過收集近年來知母的研究論文進(jìn)行分析，從知母多糖的提取分離純化、化學(xué)成分和藥理作用分別進(jìn)行介紹。

1 提取分離純化

多糖提取的原料一般采用傳統(tǒng)中藥或一些待研究植物的干品，將其粉碎過篩，烘干備用。目前多糖的種類繁雜，存在于植物的部位也各不相同，因此，提取方法因目標(biāo)物的不同而不同。常用的多糖提取方法有水提、堿提、超聲抽提以及其他提取劑的提取[13-14]。采用上述提取方法獲得的多糖提取液，都含有許多雜質(zhì)，主要是無機(jī)鹽、單糖、寡糖、低分子量的非極性物質(zhì)、高分子量的有機(jī)雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、木質(zhì)素)及一些色素[15]，因此，需要對(duì)其進(jìn)行純化[16]。常采用的純化方法有透析法、凝膠色譜法、超濾法[17]。常用的除蛋白的方法有Sevag法脫蛋白，Sevag法結(jié)合酶法脫蛋白[18]，三氯乙酸法、酶解法、鞣酸法等。常用的脫色方法有吸附法、氧化法、離子交換法、金屬絡(luò)合物法等[19]。常采用離子交換柱層析、分子篩排阻層析、有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)行分級(jí)純化[20]。

王靖等[21]將知母浸泡后得到勻漿后用溫度75 ℃蒸餾水進(jìn)行水浴，離心，上清用乙醇分級(jí)醇沉，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚依次洗滌沉淀物，將沉淀物真空干燥后即為知母粗多糖。黃芳等[22]將知母按料液比1∶10水煎煮2次/h進(jìn)行提取。合并提取液過濾后濃縮，濃縮液加入高濃度乙醇，使乙醇濃度達(dá)到70%，進(jìn)行分級(jí)沉淀得到粗多糖。利用 Sevag法去除蛋白質(zhì)得到知母總多糖。李炳輝等[23]基于單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)，對(duì)知母多糖的理論得率進(jìn)行預(yù)測，確定知母多糖提取的最佳工藝參數(shù)：液料比11 mL/g，提取2次，提取時(shí)間117 min，提取功率92 W，理論上知母多糖得率可達(dá)30.18%。

2 化學(xué)成分

多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，與蛋白質(zhì)和核酸相比，多糖的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，可稱之為最復(fù)雜的生物大分子。糖的結(jié)構(gòu)沿用了蛋白質(zhì)和核酸的分類方法，可分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)。在多糖的結(jié)構(gòu)分析中，一級(jí)結(jié)構(gòu)是最重要的，二級(jí)～四級(jí)結(jié)構(gòu)與多糖的生物功能及其構(gòu)效關(guān)系有著十分重要的關(guān)系[24-26]。

知母多糖類成分在知母中占有相當(dāng)大的比例，但由于研究水平和技術(shù)條件的限制，多糖結(jié)構(gòu)鑒定非常困難。目前結(jié)構(gòu)特征較明確的知母多糖主要有知母多糖A、B、C、D，其分子量分別為1.2×106，6.0×104，2.4×104，6.5×104，經(jīng)酸水解后，知母多糖A含有Rha、Ara、Xyl和Gal，知母多糖B含有Rha、Ara、Xyl和Glc，知母多糖C含有Fuc、Ara、Xyl、Gal和Glc，知母多糖D含有Man和Glc[27]。

王靖等[21]從知母中分離純化得多糖PS-Ⅰ精品，分子量約為190萬，單糖組成為D-甘露糖和D-葡萄糖。呂太勇等[28]分離純化得AAB1精品，經(jīng)HPLC、比旋光度測定等方法，AAB1為均一酸性雜多糖，分子量約為5.47×104，經(jīng)氣相色譜分析，表明AAB1由D-木糖(Xyl)、Man、D-半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)和Glc組成，摩爾比為1∶11∶1.75∶7.92∶1.2。楊東升[29]以地道藥材“西陵知母”為研究對(duì)象測得知母總多糖的含量為14.33%。分離純化后成功得到知母均一多糖，中性多糖A-1，酸性多糖B-1，B-2。分子量分別為201 000、41 100、10 500。筆雪燕[30]經(jīng)氣相色譜分析分離并鑒定了4種均一糖，AAP3(Rha：Fuc：Ara：Man：Glc摩爾比為38.92∶1.55∶9.26∶2.28∶9.64)，AAP4(Rha：Fuc：Ara：Man：Glc糖摩爾比為31.86∶3.27∶18.4∶1.99∶7.18)，AAP5(Rha：Ara：Man：Glc糖摩爾比為38.23∶3.59∶32.06∶0.99)，AAP6(Rha：Ara：Man：Glc糖摩爾比為31.11∶3.48∶38.23∶2.82)。周曉歡[31]利用離子交換和凝膠層析對(duì)知母酸性總糖進(jìn)行了分離純化并得到5個(gè)不同級(jí)分WABP-A2a(975 KDa)、WABP-A2b(104 KDa)、WABP-A2c(3 KDa)、WABP-A3a(1 013 KDa) 和 WABP-A3b(26 KDa)。采用甲基化分析、紅外光譜分析、核磁共振對(duì)均一級(jí)分WABP-A2a、WABP-A2b和WABP-A3a進(jìn)行了單糖組成測定。這3個(gè)部分被證明為連有較多的中性糖側(cè)鏈的RG-Ⅰ型果膠結(jié)構(gòu)域。側(cè)鏈中的糖苷鍵主要類型包括α-1，5-Ara，其中部分Ara的O-3位置被取代，t-Ara鏈接，高度支化，還含有AG-Ⅰ型果膠側(cè)鏈中的β-1，4-Gal，WABP-A2b中還含有β-1、6-Gal、β-1、3,6-Gal，以及少量的AG-Ⅱ側(cè)鏈。采用紅外光譜、核磁共振、果膠酶酶解對(duì)均一級(jí)分WABP-A2c和WABP-A3b進(jìn)行單糖組成測定，證明WABP-A2c和WABP-A3b的結(jié)構(gòu)中主要為HG型果膠，以及少量的RG-Ⅰ和RG-Ⅱ結(jié)構(gòu)域。三種結(jié)構(gòu)域在WABP-A2c和WABP-A3b中具有不同的比例，并通過共價(jià)鍵進(jìn)行連接。

3 藥理作用

多糖是一種高分子碳水化合物，通過糖苷鍵連接起來的長鏈，由多個(gè)單糖單元組成[32]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到多糖同蛋白質(zhì)[33]、核酸一樣都是非常重要的生物大分子，在生物體的生長和發(fā)育上發(fā)揮重要作用[34]。目前學(xué)界對(duì)于多糖活性[35]相關(guān)研究主要集中在抗病毒、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面[36-37]?？寡趸譃橐詣?dòng)物模型為基礎(chǔ)的體內(nèi)活性評(píng)價(jià)及基于化學(xué)及儀器分析方法的體外模型評(píng)價(jià)，調(diào)節(jié)免疫活性[38-39]是以通過激活巨噬細(xì)胞，激活T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞。降血糖活性主要通過多糖調(diào)節(jié)胰島素并影響糖代謝中的酶活，使組織對(duì)葡萄糖的產(chǎn)生作用，從而調(diào)節(jié)血糖含量，對(duì)糖尿病的防治和治療有一定幫助[40]。目前學(xué)者的研究重心大多集中在皂苷及苷元類上[41]。

3.1 抗炎作用

知母總多糖可以顯著改善由二甲苯引起小鼠耳廓腫脹和醋酸導(dǎo)致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高引起的炎癥反應(yīng)[42]。陳萬生等[43]通過實(shí)驗(yàn)證明模型證實(shí)知母總多糖對(duì)炎性滲出增加及組織水腫、急性毛細(xì)血管通透性增高等由多種致炎劑引起的一系列反映均有明顯的抑制作用。對(duì)慢性肉芽腫增生有顯著抑制作用。知母總多糖通過抑制前列腺素E的合成或者釋放，從而使炎癥組織中PGE顯著減少。雷霞等[44]通過DNFB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)模型證實(shí)知母多糖組分能顯著降低耳腫脹度，抑制T細(xì)胞增殖;調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答，減輕耳部炎癥與免疫損傷;抑制LPS誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制TNF-α和NO釋放，呈現(xiàn)出抗炎的功效。

3.2 降血糖作用

知母藥材是為常見的中藥材，現(xiàn)代臨床上人們多用于治療糖尿病[45]。Kimura等[46]采用口服給藥進(jìn)行研究降血糖方面的研究。王靖等[47]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)知母多糖具有明顯的降血糖作用，無論是灌胃還是腹腔給藥，均能降低正常小鼠和四氧嘧啶型小鼠的血糖；也能降低正常小鼠肝糖元的含量。知母多糖抑制α-糖苷酶可能是降低糖尿病模型家兔和小鼠血糖的作用機(jī)制。陳麗華等[48]研究報(bào)道了知母多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性隨時(shí)間的變化先激活后抑制。孫洪偉[49]改進(jìn)提取工藝得到較純的知母聚糖。證實(shí)了知母聚糖對(duì)胰島D細(xì)胞受損有修復(fù)作用。使用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型(該模型類似于1型糖尿病)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，知母聚糖可以提高鼠骨骼肌對(duì)血液中葡萄糖的攝取能力。2型糖尿病的重要特征是骨骼肌對(duì)葡萄糖攝取障礙，由此推斷出知母聚糖不僅僅對(duì)1型糖尿病發(fā)揮作用，同樣對(duì)2型糖尿病也是有降血糖作用。盧盛華等[50]提取了知母中知母聚糖A、B、C、D的混合物，研究得出知母聚糖能降低正常小鼠和糖尿病大鼠(四氧嘧啶誘發(fā))的血糖，增高肝糖原含量、增加骨骼肌對(duì)3H-2-脫氧葡萄糖攝取能力，同時(shí)可以減輕四氧嘧啶造成的胰島組織的損害，其降血糖作用與增加骨骼肌對(duì)3H-2-DG攝取、減少肝糖原分解、增加肝糖原合成、使尚未遭到嚴(yán)重?fù)p害的胰島β細(xì)胞恢復(fù)正常有關(guān)。黃彩云等[51]研究發(fā)現(xiàn),知母多糖可降低家兔糖尿病(四氧嘧啶型)的血糖，知母多糖反而對(duì)正常家兔的血糖影響比較小，與D860(甲苯磺丁脲)相比，作用時(shí)間快，持續(xù)時(shí)間短。降血糖的機(jī)理可能與增加葡聚糖的利用有關(guān)，促進(jìn)脂肪組織對(duì)葡聚糖的攝取，使血糖降低，從而產(chǎn)生降血糖作用。姚桂香[52]從知母根莖中分離得到的知母聚糖A、B、C、D具有降血糖作用，其中B的活性最強(qiáng)。朱建成等[53]建立大鼠紅細(xì)胞磷脂的代謝組學(xué)判別模型，綜合運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法尋找知母多糖治療2型糖尿病的紅細(xì)胞磷脂藥理標(biāo)志物。通過交叉檢驗(yàn)及置換檢驗(yàn)證明，模型可以充分提取組間差異，并具有較好的預(yù)測能力。篩選得到的知母多糖紅細(xì)胞磷脂標(biāo)志物可為后續(xù)的作用機(jī)制研究提供參考。劉印等[54]研究了知母多糖可以增加大鼠體質(zhì)量，并改善對(duì)葡萄糖的耐受能力;降低FBG水平，提高FINS水平；也可以降低模型大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝組織MDA含有量，提高肝組織CAT、SOD活性，同時(shí)，知母多糖還可以減少肝組織Phospho-IRS1表達(dá)，增加Glut4表達(dá)。侯紅瑞等[55]研究分子量在30～100 kDa知母多糖對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病SD大鼠的降血糖效果及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)對(duì)糖尿病SD大鼠的有明顯的降血糖、降血脂效果，該作用機(jī)制可能與改善胰島素抵抗和修復(fù)受損胰島細(xì)胞組織有關(guān)。

3.3 抗氧化作用

3.4 其他作用

盧盛華等[50]研究發(fā)現(xiàn)知母多糖可以用作醛糖還原酶抑制劑，以緩解糖尿病的并發(fā)癥。醛糖還原酶在糖性白內(nèi)障的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用，還與糖尿病引起的一系列病變有關(guān)，例如角膜、視神經(jīng)及外周神經(jīng)的病變[59]。雷霞等[60]對(duì)知母鹽炙前后水煎液通便作用及化學(xué)成分進(jìn)行比較研究，通過觀察生知母、鹽知母水煎液對(duì)便秘大鼠的通便作用，糖類化合物可能是其滋陰降火作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是知母甘味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

現(xiàn)階段對(duì)知母的質(zhì)量評(píng)價(jià)[61]及其藥效研究主要集中在皂苷類和黃酮類等成分上，究其原因，主要是國內(nèi)目前對(duì)知母多糖的分離和純化缺乏系統(tǒng)的研究[62]。化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、純度較高的知母多糖對(duì)照品也將成為影響知母藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和完善的一個(gè)極其重要的因素。多糖及共綴合物的研究可以追溯到100多年前，在生物化學(xué)領(lǐng)域，由于人類的不斷努力，在微觀細(xì)胞水平上逐漸進(jìn)行了有關(guān)活性多糖的機(jī)理機(jī)制研究，在研究較成熟的多糖(香菇多糖)已有了分子水平的發(fā)現(xiàn)[63]。對(duì)多糖類的研究雖然也取得了一些巨大成就，但與蛋白質(zhì)和核酸的研究相比，多糖類的研究還不夠深入，還具有很大差距，任重而道遠(yuǎn)。