張瑞，張鳳云，黃雪元

(上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201800)

慢性阻塞型肺病 (COPD)是一種慢性非特異性炎癥性疾病[1]，“痰濁壅肺證”是COPD急性加重期(AECOPD)的最主要證型之一。中醫(yī)證候傳統(tǒng)研究手段缺乏客觀的診斷標(biāo)準(zhǔn)，使方劑療效難以正確評(píng)價(jià)。目前代謝組學(xué)廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥證本質(zhì)科研研究，本研究運(yùn)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOFMS)技術(shù)尋找中醫(yī)AECOPD“痰濁壅肺證”的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，以期從系統(tǒng)生物學(xué)水平探討中醫(yī)“證”的本質(zhì)，為臨床診斷、治療疾病提供客觀依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年4月—2019年4月上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診及住院確診為COPD急性加重期，經(jīng)中醫(yī)辨證為痰濁壅肺證的60例患者作為疾病組。其中男性患者30例，女性患者30例；年齡(65.83±7.75)歲；病情嚴(yán)重程度GOLD 2級(jí)36例，GOLD 3級(jí)24例；病程(16.88±6.09)年;BMI(22.13±3.21)kg/m2；合并高血壓者32例，2型糖尿病者33例，冠心病者21例。

本研究共納入同期在我院體檢中心的體檢的健康受試者30例作為對(duì)照，年齡60～80歲，男性15例，女性15例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

疾病組：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及病情嚴(yán)重程度分級(jí)參照2016年GOLD診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]。主證：咳嗽，喘息氣促，咳痰黏稠量多，色白或成泡沫狀；次證：喉間痰鳴，喘息不能平臥，胸部膨滿，憋悶如塞，納呆，脘腹脹滿，肢體困重，大便秘結(jié)或不暢；舌脈：舌暗，苔薄膩或濁膩，脈小滑。具備主癥及次癥中≥2項(xiàng)者，結(jié)合舌象、脈象，即可診斷。健康組：參照《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》中平和質(zhì)的判定標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合上述西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)符合肺脹病痰濁壅肺證中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，患者氣流受限程度根據(jù)2016年慢性阻塞性肺疾病全球倡議[2](GOLD)納入GOLD2級(jí)、GOLD3級(jí)患者，能夠完成肺功能檢測(cè)，第1秒用力呼氣量(FEV1)%為30%～80%，吸入支氣管舒張劑后FEV1/用力肺活量(FVC)%<70%，年齡60～80歲，且病情屬于1周之內(nèi)急性加重期，所有受試者均簽署知情同意書并經(jīng)上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

COPD伴有呼吸衰竭同時(shí)需要機(jī)械通氣者；因肺部腫瘤、肺結(jié)核、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺病等原因?qū)е碌穆源然颊?；發(fā)病時(shí)有嚴(yán)重的心功能不全，肝、腎功能不全等諸臟器功能不全，造血系統(tǒng)疾病和精神疾病患者。

1.5 標(biāo)本采集和制備

疾病組治療前24 h內(nèi)于清晨6:00左右在室溫下釆取靜脈4 mL，血液樣本在室溫下自然凝固1 h，收集血清，留置于EDTA管中，3 000 r/min離心10 min后收集血漿置于1.5 mL Eppendorf管中，置于液氮萃取后轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 代謝物檢測(cè)和分析

代謝組學(xué)的檢測(cè)和分析與上海百趣生物科技有限公司共同完成，包括樣品的處理、GC-TOFMS測(cè)試和數(shù)據(jù)處理分析部分。

1.6.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器：Agilent 7890A GC-MS色譜儀(Agilent)；PEGASUS HT質(zhì)譜儀(LECO)；DB-5MS色譜柱(Agilent)；Heraeus Fresco17冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)；Forma 900 series超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientific)。

試劑：甲醇(CNW Technologies)；氯仿、吡啶、甲氧胺鹽、L-2-氯苯丙氨酸、BSTFA及各化合物標(biāo)準(zhǔn)品(Adamas)；FAMEs(REGIS Technologies)；純水由Merck Millipore系統(tǒng)制備。

1.6.2 樣品處理

100 μL血清加入4倍體積冷甲醇及再加入10 μL L-2-氯苯丙氨酸沉淀蛋白，離心取上清液低溫減壓干燥；各樣本分別取40 μL混合制備混合血清進(jìn)行質(zhì)量控制(quality control，QC)，按相同方法進(jìn)行前處理；提取物用30 μL甲氧胺鹽試劑， 80 ℃孵育30 min后向每個(gè)樣品中加入40 μL BSTFA溶解，70 ℃孵育90 min；之后加入5 μL FAMEs(溶于氯仿)，隨機(jī)順序上機(jī)檢測(cè)。

1.6.3 分析條件

色譜條件：DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱；進(jìn)樣口溫度280 ℃，不分流模式，進(jìn)樣量 1 μL，載氣(高純氦)流速為3 mL/min；柱箱升溫程序?yàn)?0 ℃保持1 min后，以10 ℃/min升至310 ℃，保持8 min。

質(zhì)譜條件：標(biāo)準(zhǔn)EI離子源,電離電壓-70 eV，離子源溫度250 ℃，在全掃描模式下采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量范圍(m/z)50～500，掃描速率12.5 spectr/s。

1.6.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用ChromaTOF軟件(V 4.3x，LECO)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，使用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫對(duì)物質(zhì)定性，匹配質(zhì)譜及保留時(shí)間指數(shù)，將QC樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。得到的峰表輸入Simca 15.0.2件進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)。然后進(jìn)行置換檢驗(yàn)對(duì)模型有效性做進(jìn)一步檢驗(yàn)，即隨機(jī)改變變量Y的順序得到不同的隨機(jī)Q2值。按照VIP(variable importance projection,VIP)>1，T檢驗(yàn)(T-Test)P<0.05的條件進(jìn)行篩選后，通過檢索在線數(shù)據(jù)庫(KEGG、HMDB、PubChem)定性可能的差異性代謝物。

2 結(jié)果

2.1 疾病組與健康組的PCA結(jié)果

比較樣本基本處于95%置信區(qū)間，疾病組與健康組主要成分得到了完全的分離，說明兩組間代謝物存在顯著差異；該模型主成分累計(jì)解釋率為R2X(cum)=0.473，說明建立的PCA模型可靠。詳見圖1。

注：R2X=0.473圖1 疾病組與健康組的PCA得分散點(diǎn)圖

2.2 疾病組與健康組OPLS-DA及對(duì)模型的驗(yàn)證比較

疾病組和健康組的血清樣品OPLS-DA圖中，樣本處于95%置信區(qū)間，兩組樣本區(qū)分非常顯著，R2Y非常接近1，Q2非常接近1，表明當(dāng)前模型較為真實(shí)可靠，可以解釋兩組之間的差異代謝物。置換檢驗(yàn)建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA模型獲得隨機(jī)模型的Q2值均小于原模型的Q2值；置換的Y變量比例增大，表面模型具有良好的穩(wěn)健性，擬合良好。結(jié)果見圖2。

2.3 潛在證候標(biāo)記物

對(duì)疾病組和健康組分組貢獻(xiàn)較大的重要變量因子VIP值進(jìn)行提取，保留VIP>1的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的代謝物作為差異代謝物。利用KEGG、HMDB、PubChem等相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，結(jié)果對(duì)代謝物鑒定和代謝通路分析后找到主要17種差異代謝物與本研究有重要貢獻(xiàn)，其升級(jí)趨勢(shì)等相關(guān)信息如表1所示，其中牛磺酸、蘇氨酸2種在疾病組中呈下降趨勢(shì)，其余15種呈上升趨勢(shì)，代謝差異物熱圖見圖3。

3 討論

慢性阻塞型肺病(COPD)歸屬“肺脹”范疇，古代眾多醫(yī)家認(rèn)為COPD的發(fā)生多由久病肺虛,痰濁潴留,每因再感外邪誘使病情發(fā)作加重，病機(jī)以痰為根本。痰濁壅肺為急性加重期最常見證型之一，臨床表現(xiàn)上患者咳、痰、喘癥明顯加重，此階段患者咳吐痰濁較多。筆者前期基于“痰濁壅肺證”進(jìn)行了一系列藥物療效觀察和藥物作用機(jī)制研究方面的研究[5]，但中醫(yī)證候缺乏明確統(tǒng)一的客觀化、量化指標(biāo)，對(duì)臨床證型的統(tǒng)一造成了一定的障礙，也對(duì)臨床治療造成一定的困擾。

注：R2X=0.15，R2Y=0.98，Q2=0.958；截距：R2=(0，0.31)，Q2=(0，-1.57)圖2 兩組血清樣品OPLS-DA得分散點(diǎn)圖(左)和置換檢驗(yàn)圖(右)

圖3 兩組代謝物的熱圖

表1 COPD急性加重期痰濁壅肺證潛在有重要貢獻(xiàn)的證候標(biāo)志物及變化趨勢(shì)

注：mass表示物質(zhì)特征離子的質(zhì)荷比,VIP表示OPLS模型中代謝物變量的影響因子,fold Change表示該物質(zhì)在該組對(duì)比兩組實(shí)驗(yàn)間的倍數(shù)關(guān)系。

中醫(yī)證候反映了機(jī)體整體某一時(shí)刻的外在宏觀表現(xiàn)，而代謝組學(xué)從整體水平闡明了機(jī)體的內(nèi)在微觀變化，更能揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)。在“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的時(shí)代，眾多學(xué)者從代謝組學(xué)層面研究中醫(yī)證型實(shí)質(zhì)研究上做出了大量有益的探索，取得了很多研究成果。痰熱壅肺型AECOPD主要和能量代謝和蛋白質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，患者血清中丙酮酸、3-羥基丁酸、賴氨酸、谷氨酸等明顯升高，而纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等水平明顯下降[6]。COPD肺氣虛證檢測(cè)出13種物質(zhì)存在變化，其中膽酸、羊毛固醇、脂肪酸等下降，2-羥基已二酸、甲羥戊酸、硬脂酰肉堿明顯升高[7]。多囊卵巢綜合征(PCOS)痰濕證患者和健康人的血清代謝物存在差異，13 種代謝物可能是 PCOS 痰濕證潛在的生物標(biāo)志物，主要表現(xiàn)為三羧酸循環(huán)障礙、糖代謝緩慢、脂肪動(dòng)員加強(qiáng)[8]。腫瘤患者體內(nèi)脂肪代謝加強(qiáng)，多種氨基酸下降和脂肪代謝有關(guān)的代謝含量增加在痰瘀證腫瘤患者體內(nèi)比非痰瘀證腫瘤患者嚴(yán)重[9]。中醫(yī)證候痰證較非痰證患者代謝組學(xué)檢測(cè)結(jié)果在糖代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝等各方面均存在不同差異，在不同的疾病中亦各有側(cè)重。

基于GC-TOFMS技術(shù)對(duì)AECOPD痰濁壅肺證患者血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)研究，本研究結(jié)果篩選出17種有意義差異代謝物(包括氨基酸、脂肪酸、糖等)。血清中上調(diào)代謝物比較有意義的是乳酸、琥珀酸、硫辛酸、新橙皮苷、D-神經(jīng)鞘氨醇、葡萄糖、亞油酸甲酯、天門冬酰胺、尿素等；下調(diào)物質(zhì)中比較有意義的是?；撬?、蘇氨酸。

目前普遍認(rèn)為,AECOPD不僅與氣道炎癥有關(guān)，還是一個(gè)全身系統(tǒng)性炎癥，筆者前期的研究結(jié)果已證明AECOPD患者血液中某些炎癥因子水平顯著升高[5]。炎癥反應(yīng)部位使物質(zhì)分解加速,加重組織耗氧，同時(shí)炎癥反應(yīng)部位微循環(huán)障礙影響氧供，引起無氧酵解產(chǎn)生乳酸量增多。同時(shí)COPD 病人因長期處于氧供不足的狀態(tài)，糖酵解亦產(chǎn)生乳酸增多。琥珀酸是TCA中的中間代謝產(chǎn)物，在線粒體生成ATP的過程中起關(guān)鍵作用，亦可作為炎癥中的一種物質(zhì)代謝信號(hào), 促進(jìn)炎癥[10]。硫辛酸屬于B族維生素中的一類化合物，在催化α-酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酸的反應(yīng)重起轉(zhuǎn)?；饔?，能增強(qiáng)AECOPD患者抗氧化能力, 減輕氧化應(yīng)激水平, 降低相關(guān)炎癥因子水平, 起到抗炎、抗氧化作用, 從而改善肺功能[11]。新橙皮苷在是一種天然的強(qiáng)抗氧化劑，具有抗炎的作用[12]。D-神經(jīng)鞘氨醇是神經(jīng)鞘磷脂類成分，是形成生物膜的重要脂類成分。神經(jīng)鞘氨醇相關(guān)物質(zhì)可結(jié)合腫瘤細(xì)胞或炎癥細(xì)胞表面的受體,增強(qiáng)其下游的IL-6表達(dá),增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，含量增高可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)增大[13]。以上物質(zhì)水平增高均提示炎癥反應(yīng)增強(qiáng)及其導(dǎo)致機(jī)體自身抗炎能力得到發(fā)揮。?；撬崾且环N抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣、調(diào)節(jié)滲透壓以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)[14]。氧化應(yīng)激與炎癥高度相關(guān)，AECOPD患者?；撬岷拷档停赡芘c COPD病人氧化應(yīng)激增強(qiáng)，牛磺酸消耗程度較高相關(guān)。

基于代謝組學(xué)方面，機(jī)體的能量代謝過程是伴隨著物質(zhì)的徹底氧化分解過程。天冬酰胺可以與天冬氨酸相互轉(zhuǎn)化，天冬氨酸是合成延胡索酸(三羧酸循環(huán)中間體)的前體物質(zhì)[15]，并可作為底物生成的谷胱甘肽和草酰乙酸,具有抗氧化功能并與琥珀酸參與三羧酸循環(huán)，提供能量。機(jī)體主要是利用血液提供的葡萄糖供能，葡萄糖、木糖、麥芽糖等葡萄糖代謝物增多及琥珀酸等三羧酸循環(huán)代謝中間體的上調(diào)表明了COPD急性加重期急性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激使機(jī)體能量代謝處于比較旺盛的狀態(tài)。同時(shí)隨著炎癥反應(yīng)產(chǎn)生機(jī)體能量代謝需求增加，脂肪的代謝增加。D-神經(jīng)鞘氨醇、亞油酸甲酯、4-羥基丁酸乙酰酯等脂質(zhì)及分解產(chǎn)物呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)，提示脂肪酸代謝發(fā)生紊亂。氨基酸的代謝紊亂主要體現(xiàn)在尿素生成增加及蘇氨酸的下調(diào)。尿素是蛋白質(zhì)代謝的主要產(chǎn)物，炎癥反應(yīng)時(shí)尿素水平的升高可認(rèn)為是炎癥狀態(tài)下蛋白質(zhì)的分解代謝增強(qiáng)所致。蘇氨酸是一種必需的氨基酸，參與動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能[16]。蘇氨酸的含量相對(duì)減少, 說明AECOPD患者免疫力相對(duì)較低下, 正是COPD患者因?yàn)槊庖呦陆挡艑?dǎo)致病情反復(fù)加重。

本研究證明伴隨著體內(nèi)炎癥反應(yīng)，AECOPD痰濁壅肺證患者血清代謝譜發(fā)生了特異性變化，能量代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝發(fā)生了紊亂，鑒定出的差異代謝物及相關(guān)代謝通路可以為更深入的研究中醫(yī)證本質(zhì)提供參考依據(jù)。