嚴(yán)芮雯,陳旭青,嚴(yán)道南

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

過(guò)敏性鼻炎是常見(jiàn)的發(fā)生在鼻部的非感染性炎性疾病(Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)),臨床癥狀嚴(yán)重影響了人們的生活、工作、學(xué)習(xí)，尤其影響了兒童的生長(zhǎng)發(fā)育。NK細(xì)胞是人體非特異性免疫系統(tǒng)的組成部分，是機(jī)體抗病毒、抗感染以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中不容忽視的效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)似于T細(xì)胞，NK細(xì)胞在不同的條件下亦分化為NK1/NK2型細(xì)胞亞群。臨床研究表明，益氣溫陽(yáng)方治療變應(yīng)性鼻炎肺脾虛寒證有很好的療效，能很好的緩解變應(yīng)性鼻炎臨床癥狀[1]。本研究主要通過(guò)研究益氣溫陽(yáng)方對(duì)NK細(xì)胞刺激活化后的亞群NK1型細(xì)胞、NK2型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ的影響，來(lái)分析益氣溫陽(yáng)方對(duì)NK細(xì)胞分化的影響，初步探討益氣溫陽(yáng)方對(duì)變應(yīng)性鼻炎患者機(jī)體免疫細(xì)胞NK細(xì)胞的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量25～30 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，按5只/籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)別飼養(yǎng)環(huán)境，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTekInstruments公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；37 ℃恒溫箱(北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司)；小型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó) Sigma公司)。

1.1.3 試劑

IL-5 Mouse ELISAKit(美國(guó) eBioscience)；IL-5 Mouse ELISA Kit(美國(guó) eBioscience)；RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó) Gbico公司)；OVA(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.4 藥物

益氣溫陽(yáng)方組成：黨參10 g，黃芪15 g，干姜9 g，桂枝10 g，麻黃6 g，五味子10 g，地龍10 g，烏梅10 g和甘草3 g。加水常規(guī)煎煮，濾液分別濃縮至1.4 g/mL、0.7 g/mL、0.35 g/mL，4 ℃保存。

鹽酸左西替利嗪片由重慶華邦制藥有限公司生產(chǎn)，5 mg×15片。

刺激劑：高爾基體+粉塵螨代謝培養(yǎng)基提取液，過(guò)濾除菌，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型準(zhǔn)備

30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、益氣溫陽(yáng)方低劑量組、益氣溫陽(yáng)方中劑量組、益氣溫陽(yáng)方高劑量組和西替利嗪組共6組。除空白組外，在第0天、第7天，第14天以40 μg的OVA作抗原，2 mg氫氧化鋁作免疫佐劑，加0.9% NaCl溶液定容至400 μL，腹腔注射小鼠進(jìn)行致敏，空白組以等量生理鹽水代替；從第21天開(kāi)始，用10%的OVA 溶液滴入小鼠鼻腔，每側(cè)各20 μL進(jìn)行激發(fā)，每天激發(fā)1次，持續(xù)7 d，空白組以等量生理鹽水代替。

1.2.2 藥物干預(yù)

自造模第21天～第27天，對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，益氣溫陽(yáng)方低劑量組、中劑量組、高劑量組以及西替利嗪組分別按0.07 g/(10 g·d)、0.14 g/(10 g·d)、0.28 g/(10 g·d)、16.67 μg/(10 g·d)給藥，各組均按0.2 mL/(10 g·d)液體量灌胃，模型組和空白組以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 取含藥血清

灌胃7 d后采用腹主動(dòng)脈真空采血管取血，室溫靜置1 h，2 500 r/min，4 ℃離心20 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，過(guò)濾除菌，-20 ℃保存。

1.2.4 原代NK細(xì)胞的分離純化

取正常小鼠，處死后分離脾臟，移至操作顯微鏡下，剝離血管膜，剪碎組織；以0.125%胰酶混懸后放入CO2培養(yǎng)箱中消化20 min，5 min搖晃一次；加入1 mL血清終止消化，靜置2 min后移去上清；加入2 mL全培緩慢、連續(xù)吹打10次，靜置后吸取上清，反復(fù)3次，取得單細(xì)胞混懸液；參照NK Cell Isolation KitⅡ試劑盒，以磁性納米微球結(jié)合NK細(xì)胞特異性抗原，將結(jié)合后的細(xì)胞混懸液經(jīng)過(guò)特定磁場(chǎng)吸附NK細(xì)胞，分離得到NK細(xì)胞混懸液。

1.2.5 體外刺激NK細(xì)胞

10%含藥或空白血清RPMI 1640完全培養(yǎng)基制備3.75×105個(gè)/mL NK細(xì)胞混懸液，移500 μL細(xì)胞混懸液于24孔內(nèi)，除空白組外，每組加入高基體阻斷劑+佛波酯+離子霉素或高基體阻斷劑+塵螨試劑； CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。

1.2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ

回收上清，采用Elisa技術(shù)，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別檢測(cè)IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ的樣本含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)及造模期間動(dòng)物一般狀態(tài)

灌胃第3天，部分西替利嗪組及益氣溫陽(yáng)方高劑量組小鼠大便稀，灌胃第5天，1只益氣溫陽(yáng)方中劑量組小鼠由于灌胃針刺較深，小鼠抽搐死亡。余小鼠在干預(yù)及造模期間無(wú)特殊情況，毛色、攝食量、行為、大小便等一般狀態(tài)基本正常。

2.2 NK細(xì)胞混懸液流式純度檢測(cè)

本次實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為CD3-、CD16+、CD56+NK細(xì)胞，提取的NK細(xì)胞流式純度檢測(cè)結(jié)果如圖1示，CD3目標(biāo)抗原沒(méi)有表達(dá)(染色陰性)，CD56和CD16兩種目標(biāo)抗原都有表達(dá)(雙陽(yáng)性)。

圖1 NK細(xì)胞混懸液流式純度檢測(cè)

2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

益氣溫陽(yáng)方能抑制NK2型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-4、IL-5分泌(P<0.05)，其中益氣溫陽(yáng)方中劑量組抑制NK2型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-4、IL-5分泌作用最明顯(P<0.05)，與西替利嗪組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。益氣溫陽(yáng)方對(duì)能促進(jìn)NK1型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10分泌(P<0.05)，其中益氣溫陽(yáng)方中劑量組對(duì)促進(jìn)NK1型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10分泌作用最明顯(P<0.05)，但益氣溫陽(yáng)方對(duì)NK1型細(xì)胞因子INF-γ分泌無(wú)促進(jìn)作用(P<0.05)。西替利嗪組能抑制NK2型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-4、IL-5分泌(P<0.05)，抑制作用高于益氣溫陽(yáng)方低、高劑量組(P<0.05)，與益氣溫陽(yáng)方中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；西替利嗪組能促進(jìn)NK1型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10分泌(P<0.05)，效果均高于益氣溫陽(yáng)方組(P<0.05)；但西替利嗪組對(duì)NK1型細(xì)胞因子INF-γ分泌無(wú)促進(jìn)作用(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞因子水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較，△P<0.05。

3 討論

NK細(xì)胞是能夠分泌免疫細(xì)胞因子的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，具有固有免疫和適應(yīng)性免疫雙重特性。大量實(shí)驗(yàn)證明變應(yīng)性鼻炎主要是由IgE介導(dǎo)的，多種免疫細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)因子參與的細(xì)胞免疫系統(tǒng)紊亂的鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)，而NK細(xì)胞作為免疫淋巴細(xì)胞，是維持免疫環(huán)境的穩(wěn)定以及機(jī)體正常免疫功能的重要一員。因此當(dāng)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生時(shí)，免疫功能失常，刺激NK細(xì)胞活化，誘導(dǎo)NK細(xì)胞分化成NK1和NK2型細(xì)胞，分泌出一系列促炎反應(yīng)類(lèi)以及免疫抑制類(lèi)細(xì)胞因子，變應(yīng)性鼻炎患者表現(xiàn)為明顯的NK2型偏倚。

NK細(xì)胞通常是CD3-、CD56+、CD16+，TCR-，BCR-的淋巴樣細(xì)胞，CD56+NK細(xì)胞亞群主要參與細(xì)胞因子的分泌，本實(shí)驗(yàn)提取培養(yǎng)的主要為CD56+NK細(xì)胞亞群。在臨床研究中，Peritt等[2]發(fā)現(xiàn)在一定條件下培育CD16+或CD56+NK細(xì)胞，能誘導(dǎo)出分泌INF-γ的NK1型亞群和分泌IL-5和IL-13的NK2型亞群。Katsumoto等[3]認(rèn)為IL-2和IL-12能誘導(dǎo)NK1型細(xì)胞分泌INF-γ、IL-10，NK2型亞群產(chǎn)生IL-5和IL-13，NK2型偏倚的原因主要是由于INF-γ減少，而Wei等(4)認(rèn)為NK2型偏倚的原因主要是IL-4的增多。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎小鼠NK細(xì)胞細(xì)胞因子INF-γ、IL-4分泌增多明顯，表明變應(yīng)性鼻炎小鼠NK2型偏倚可能主要是由于IL-4的增多。

變應(yīng)性鼻炎被稱為“鼻鼽”，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為鼻鼽主要是由于肺氣虛寒，肺衛(wèi)不固，外邪趁虛而入，鼻為肺之外竅，外邪侵犯，首當(dāng)其沖，肺氣失宣，鼻竅氣機(jī)不暢，津液停聚，以致患者發(fā)生鼻塞、鼻癢、流清涕等臨床癥狀。現(xiàn)代研究表明，中醫(yī)治療變應(yīng)性鼻炎主要是通過(guò)運(yùn)用抗過(guò)敏作用的中藥以及通過(guò)調(diào)節(jié)臟腑氣血陰陽(yáng)運(yùn)行平衡，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境來(lái)提高機(jī)體抵抗外界過(guò)敏原的免疫功能。益氣溫陽(yáng)方中麻黃宣肺平喘利水，桂枝解表散寒、溫肺化飲，二者相伍增強(qiáng)通陽(yáng)宣散解表之力，大量藥理學(xué)研究表明，兩者都具有很好抗炎抗過(guò)敏的作用[5-6]；干姜味辛，大熱，溫中散寒、溫肺化飲；五味子、烏梅味酸，都具有斂肺止咳之效，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，五味子和烏梅[7-8]都具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以提高機(jī)體的免疫力；黃芪益氣固表、補(bǔ)養(yǎng)氣血，對(duì)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫都有很好的促進(jìn)作用[9]；黨參健脾益氣、補(bǔ)氣養(yǎng)血，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有很強(qiáng)的增強(qiáng)作用[10]；辛夷祛風(fēng)散寒、通鼻竅，具有抗過(guò)敏的功效，是治療過(guò)敏性鼻炎的要藥；地龍性寒，清熱平喘，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，地龍具有抗組胺、提高免疫的作用[11]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究益氣溫陽(yáng)方引起活化后的NK1型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10、INF-γ以及NK2型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-4、IL-5分泌的改變，說(shuō)明本方可以抑制NK2型細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)NK1型細(xì)胞因子的表達(dá)，提示益氣溫陽(yáng)方治療變應(yīng)性鼻炎的機(jī)制可能與其抑制NK2型細(xì)胞活化，促進(jìn)NK1型細(xì)胞活化有關(guān)。

西替利嗪是公認(rèn)治療AR比較有效的抗過(guò)敏藥，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置西替利嗪為陽(yáng)性對(duì)照組，對(duì)比中醫(yī)藥的治療效果。雖然臨床上西替利嗪治療AR效果很好，但是缺少關(guān)于西替利嗪對(duì)NK細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明西替利嗪對(duì)活化后的NK1型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10有促進(jìn)作用，并抑制NK2型細(xì)胞細(xì)胞因子IL-4、IL-5分泌，這為西替利嗪調(diào)控NK細(xì)胞治療AR患者機(jī)制方面做出可能的補(bǔ)充，可以為后續(xù)西替利嗪對(duì)NK細(xì)胞的藥理作用研究提供一些參考。

本次實(shí)驗(yàn)表明，益氣溫陽(yáng)方低、中、高劑量均不同程度的抑制了活化后的NK2細(xì)胞釋放IL-4、IL-5，以及促進(jìn)活化后的NK細(xì)胞釋放IL-10，其中益氣溫陽(yáng)方中劑量效果最好，最大程度抑制了IL-4、IL-5的釋放以及促進(jìn)了IL-10的釋放。綜合上述指標(biāo)可以看出，益氣溫陽(yáng)方能通過(guò)影響活化后的NK細(xì)胞促炎以及免疫抑制類(lèi)細(xì)胞因子的分泌和合成，有效干預(yù)變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制，發(fā)揮益氣溫陽(yáng)方治療變應(yīng)性鼻炎的作用。

本次實(shí)驗(yàn)將中醫(yī)藥調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡與調(diào)節(jié)活化后的NK細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌和成相結(jié)合，探索治療變應(yīng)性鼻炎的新思路，是本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)，但還存在一些問(wèn)題，如本實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞因子較少，應(yīng)該對(duì)活化后的NK細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子進(jìn)行更多的研究，體外實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步完善。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，筆者相信從現(xiàn)代科學(xué)角度闡釋、理解中醫(yī)宏觀的哲學(xué)理念將會(huì)取得很大的進(jìn)展，中醫(yī)藥在治療變應(yīng)性鼻炎疾病方面會(huì)有更大的進(jìn)步。