郭敏,劉真,張麗慧,劉雪濤,張立果,桑鋒*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000)

肝纖維化是一個(gè)病理學(xué)概念，是指肝組織內(nèi)肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)等活化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分過(guò)度增生與異常沉積，肝臟結(jié)構(gòu)或(和)功能異常的病理變化，結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為肝竇毛細(xì)血管化、匯管區(qū)與肝小葉內(nèi)纖維化；功能上可以表現(xiàn)為肝功能減退、門(mén)靜脈高壓等，是所有肝臟疾病末期并發(fā)癥的基礎(chǔ)，最終結(jié)局是形成肝硬化，甚至肝癌。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在人群中除了原發(fā)性膽汁性肝硬化外，肝纖維化男女發(fā)病率之比為2.3∶1～2.6∶1[1-2],但絕經(jīng)后女性的發(fā)病率要高于相同年齡階段的男性。研究發(fā)現(xiàn),雌激素在肝硬化進(jìn)展中可以起到保護(hù)作用[3],主要通過(guò)肝星狀細(xì)胞表面的雌激素受體及其介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路，抑制肝星狀細(xì)胞活化，從而發(fā)揮抗肝纖維作用，因此雌激素受體調(diào)節(jié)劑作為抗肝纖維化的新靶點(diǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景?；谝回灱寰哂酗@著影響雌激素水平的作用，及其在抗肝纖維化治療的廣泛應(yīng)用，本課題擬從對(duì)HSC雌激素受體影響方面進(jìn)一步探討一貫煎抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)健康雌性SD大鼠25只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(豫)2015-0004。大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院惠贈(zèng)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.2 藥物與試劑

一貫煎組成：沙參10 g，麥冬10 g，當(dāng)歸10 g，生地黃30 g，枸杞子15 g，川楝子5 g，由四川新綠色藥業(yè)提供。雌二醇由中國(guó)藥檢所提供，使用前溶于DMSO備用。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原ELISA試劑盒(博士德生物，EK0412)；ERα及ERβ引物(上海生工公司合成)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京Vazyme)；熒光定量PCR試劑盒( 南京Vazyme)；Trizol(Ambion，15596-026)。

1.3 儀器

顯微鏡LEICADM4000；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，ICV-450)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo scientific，MultiskanMK3)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-7C)；酶標(biāo)儀(Thermo，mμlISKANMK3)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-24DN)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，QuantStudio 6)；微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司，Nano-100)；紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY02S)。

1.4 含藥血清制備

藥物血清制備參照徐叔云主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》相關(guān)內(nèi)容。SPF級(jí)健康雌性SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，使用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由進(jìn)食水。分為5組，每組5只，按體表面積算出每只大鼠所需藥物(大鼠等效劑量為人體的6.3倍)，一貫煎提取物經(jīng)純凈水溶解后按高、中、低3個(gè)劑量(4.1、8.4、16.8 g/kg)灌胃；空白組：給與同等量的純凈水灌胃；陽(yáng)性組：雌二醇(0.1 mg/kg)灌胃。每天早上8點(diǎn)、晚上8點(diǎn)各給藥1次,共7天，在末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈取血,4 ℃靜置2 h，3 000 r/min,離心15 min,取血清,分離的血清同組混勻，經(jīng)恒溫水浴56 ℃ 30 min滅活補(bǔ)體，在超凈臺(tái)用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌分裝，放入-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HSC-T6細(xì)胞用含有10%熱滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2、完全飽和濕度條件下CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，用胰蛋白酶消化傳代，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-LX2細(xì)胞以一定密度(5×105/mL)在24孔板中接種。分別為空白組(加入空白組鼠血清)、雌二醇血清組、一貫煎高劑量血清組、一貫煎中劑量血清組和一貫煎低劑量血清組共5組，血清添加量為10%，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，分別收集細(xì)胞和上清液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，消化、分離，以一定密度(5×105/mL)于24孔板中接種，每孔100 μL。加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔，震搖溶解10 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的光吸收度(OD)值。

1.7 ELISA法測(cè)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)

培養(yǎng)48 h后以1 700 r/min離心5 min，收集上清液。參照試劑盒說(shuō)明用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原濃度。

1.8 Real time-PCR法檢測(cè)ERα、ERβ mRNA表達(dá)

分組培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，冰PBS液漂洗3次，加入Trizol提取細(xì)胞總RNA并檢測(cè)其濃度和純度，-80 ℃冰箱保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)終體積 20 μL，42 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃保存。引物設(shè)計(jì) 利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)ERα、ERβ及內(nèi)參GAPDH的引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。GAPDH序列：上游AACGACCCCTTCATT,GACCT下游CCCCATTTGATGTTAGCGGG，產(chǎn)物長(zhǎng)度164 kb；ERα：上游ACACCATCGATAAGAACCGG，下游TTCGGCCTTCCAAGTCATCT，產(chǎn)物長(zhǎng)度153 kb；ERβ上游ATCTGTCCAGCCACGAATCA，下游CCGTTTCTCTTGGCTTTGCT，產(chǎn)物長(zhǎng)度197 kb。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 以反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA 為模板，參照VazymeAceQ qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，35～40個(gè)循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，利用2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用比較2-△△Ct法分析ERα、ERβ mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH作為內(nèi)參基因計(jì)算各組△Ct值(即Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)，組間比較得到△△Ct 值(即兩組△Ct值相減)，通過(guò)2-△△Ct值分析組間比較目的基因的變化：2-△△Ct≥2，組間比較目的基因表達(dá)明顯增高；2-△△Ct≤0.5，組間比較目的基因表達(dá)明顯降低。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0 For Windows統(tǒng)計(jì)軟件包，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)。若P≤0.05則表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一貫煎對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

與空白組比較，作用24 h后，雌二醇組及一貫煎高劑量組表現(xiàn)出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05)；作用48 h后，雌二醇組、一貫煎各劑量組均表現(xiàn)出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05),且兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；作用72 h后，一貫煎高劑量組的抑制增殖作用優(yōu)于雌二醇組(P<0.05)。 見(jiàn)表1。

表1 一貫煎對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

注：與空白組比較，△P<0.05；與雌二醇組比較，*P<0.05。

2.2 一貫煎對(duì)HSC-T6細(xì)胞上清液Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的影響

培養(yǎng)48 h后，與空白組比較，一貫煎各劑量組均能降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的含量(P<0.05)；與雌二醇組比較，一貫煎高、中劑量組的Ⅰ型膠原含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但在降低Ⅲ型膠原含量方面，一貫煎高劑量組呈現(xiàn)明顯的優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 HSC-T6細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的含量比較

注：與空白組比較，△P<0.05;與雌二醇組比較，*P<0.05。

2.3 一貫煎對(duì)HSC-T6細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)的影響

HSC-T6細(xì)胞加入各含藥血清培養(yǎng)48 h后，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR。與空白組相比，雌二醇組、一貫煎高劑量、中劑量及低劑量組均可明顯提高ERα、ERβ mRNA表達(dá)(P<0.05)；一貫煎各劑量組較雌二醇組ERα、ERβ mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 一貫煎對(duì)HSC-T6細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)的影響

注：與空白組比較，△P<0.05；與一貫煎低劑量組比較，▲P<0.05；與一貫煎高劑量組比較，*P<0.05。

3 討論

HSC是肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的內(nèi)皮下間隙非游走的竇旁細(xì)胞，在慢性肝損傷過(guò)程中，HSC受到各種刺激后活化，活化后的HSC表現(xiàn)出難以逆轉(zhuǎn)的高增殖性、高分泌性和永生性特征，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(主要為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原)，是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此抑制HSC活化，可有效地減輕或逆轉(zhuǎn)肝纖維化[6]。

雌激素受體(estrogen receptor,ER)是一種糖蛋白，屬于甾體激素受體超家族成員，主要有ERα和ERβ兩種亞型，在心肌纖維化、腎間質(zhì)纖維化、肺纖維化等纖維化疾病中，雌激素通過(guò)與ER結(jié)合，激活雌激素應(yīng)答元件(estrogen responsive element，ERE)基因的表達(dá)，不同程度的發(fā)揮抗纖維化和保護(hù)器官功能的作用。研究發(fā)現(xiàn)[4-5],接受雌激素替代治療的絕經(jīng)女性發(fā)生肝纖維化的幾率比未接受治療的絕經(jīng)女性要低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)雌二醇具有抗肝纖維化作用可能與通過(guò)抑制TGF-β/NF-κB信號(hào)通路、抑制肝星狀細(xì)胞活性有關(guān)[6-9]；ERβ激動(dòng)劑可改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化的發(fā)生[10]。雷洛昔芬(雌激素受體調(diào)節(jié)劑)可能通過(guò)調(diào)節(jié)HSC表面的ERα改善高脂飲食誘導(dǎo)的卵巢切除雌性大鼠的肝纖維化[11-12]。林柳兵等發(fā)現(xiàn)，具有ER調(diào)節(jié)劑作用的柴胡皂苷d可提高肝星狀細(xì)胞ERα和ERβ mRNA的表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化[13-15]。因此，有效調(diào)節(jié)HSC的ER有利于延緩肝纖維化進(jìn)展。

肝纖維化可歸為“癥積”范疇，歷代醫(yī)家對(duì)肝纖維化的病因病機(jī)有不同的觀點(diǎn)。性激素可歸屬于“腎精”范疇，絕經(jīng)后女性生理特性為“腎氣虛，天癸竭”，其發(fā)生肝纖維化被認(rèn)為是肝腎同病。明代秦景明在《癥因脈治》中明確提出“乙癸同源，肝腎同治”，這一治療原則在李中梓《醫(yī)宗必讀》“東方之木，無(wú)虛不可補(bǔ)，補(bǔ)腎即所以補(bǔ)肝；北方之水，無(wú)實(shí)不可瀉，瀉肝即所以瀉腎”中得到透徹地闡發(fā)?！案文I同治”基本治則為 “滋水涵木”。通過(guò)“滋水涵木”以維持“腎精-肝血”相生、“閉藏-疏泄”統(tǒng)一和“生發(fā)-涵養(yǎng)”協(xié)調(diào)[14]。因此基于“肝腎同源”理論，從腎調(diào)治，以協(xié)調(diào)肝主生發(fā)與腎主涵養(yǎng)的調(diào)控體系，在絕經(jīng)后女性肝纖維化治療中應(yīng)用補(bǔ)益肝腎藥物，可提高臨床療效。

“一貫煎”是肝腎同治的代表方，出自清代名醫(yī)魏玉璜的《續(xù)名醫(yī)類案》，由生地黃、沙參、枸杞、麥冬、當(dāng)歸、川楝子等6味藥組成，該方有滋養(yǎng)肝腎、疏肝理氣之功。本方用一味疏肝藥川楝子以調(diào)肝木之橫逆，配入大量養(yǎng)陰藥之中，寓疏于補(bǔ)，肝腎同治，是滋陰養(yǎng)肝，疏肝開(kāi)郁的常用方,既符合肝腎同源的醫(yī)理，又暗含滋水涵木的契機(jī),魏玉璜認(rèn)為一貫煎“可通治吞酸疝瘕一切肝病”。

有研究表明,一貫煎為主的復(fù)方可改變卵巢早衰大鼠卵巢和垂體形態(tài),并可恢復(fù)卵巢周期性功能[16]。亦有研究也表明,一貫煎加減方能減輕肝腎陰虛型圍絕經(jīng)期綜合征婦女的更年期癥狀，且可升高血清中雌激素水平[17]。一貫煎具有明確的抗肝纖維化作用，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一貫煎可以抑制肝星狀細(xì)胞活化、抑制膠原的合成，促進(jìn)過(guò)度增生的膠原纖維的降解，抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化的形成[18]。一貫煎拮抗四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化的機(jī)制，可能與調(diào)節(jié)肝組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-1的含量，促進(jìn)膠原纖維降解有關(guān)[19]。研究也發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯片加用一貫煎后，可顯著改善乙肝肝硬化患者的中醫(yī)癥狀及肝臟纖維化程度[20-21]。

本研究從雌激素受體角度，觀察在“肝腎同源”理論指導(dǎo)下的一貫煎對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖及膠原含量的影響，進(jìn)一步探討一貫煎在改善絕經(jīng)后女性肝纖維化的作用機(jī)制。從細(xì)胞學(xué)角度提示，一貫煎含藥血清能夠抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量，提高HSC-T6細(xì)胞ERα、ERβ mRNA的表達(dá)。此結(jié)果表明,一貫煎抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)之一可能為肝星狀細(xì)胞的雌激素受體，同時(shí)也為一貫煎抗肝纖維化的“肝腎同治”提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。