張 彬, 雷學(xué)文, 林勝強(qiáng), 陳彥瑞

(武漢科技大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院，武漢 430065)

微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀(MICP)是一種利用微生物沉淀方解石來改善巖土性質(zhì)的生物灌漿方法，也是一個復(fù)雜的生物化學(xué)過程。很多因素：反應(yīng)物濃度和反應(yīng)時間，細(xì)菌(或者酶)的數(shù)量和活性，營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，環(huán)境條件，還有影響晶體形態(tài)的因素都會對其固化效果產(chǎn)生影響。為了確定土壤改良的最佳環(huán)境條件，并驗(yàn)證該技術(shù)在巖土工程領(lǐng)域的適用性，文獻(xiàn)[1-5]對這些因素進(jìn)行了廣泛的研。Qabany 等[6]和Okwadha 等[7]發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)菌濃度、膠結(jié)液濃度、環(huán)境 pH 和溫度都會對脲酶活性產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而影響到沉積碳酸鈣的質(zhì)量。Cheng 等[8]對比了酸堿度對膠結(jié)物含量與強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，在堿性條件下，微生物誘導(dǎo)生成的碳酸鈣質(zhì)量最多，中性條件下次之，酸性條件下最少。沈吉云[9]和趙茜[10]通過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌脲酶活性、尿素濃度、鈣離子濃度和 pH 等因素對 MICP 過程有明顯影響。陳彥瑞等[11]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MICP對玄武巖殘積土微生物固化是可行的，反應(yīng)過程中生成了碳酸鈣起到膠結(jié)作用，改變了土體的力學(xué)性質(zhì)。

一系列外在因素都會對其固化效果產(chǎn)生影響，電壓梯度對碳酸鈣的生成量也會帶來影響，而碳酸鈣的生成量直接影響MICP技術(shù)的固化效果，為此，研究不同外加電壓、不同通電時間、不同通電方式、不同鈣源條件下碳酸鈣沉積的影響規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的菌種是從上海嘉楚生物工程有限公司購買的巴氏芽孢桿菌(編號：ATCC11859)凍干粉，采用斜面培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行活化，

然后從斜面中挑取單菌落溶于液體培養(yǎng)基中，以130 r/min轉(zhuǎn)速在恒溫振蕩器中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最后將培養(yǎng)得到的細(xì)菌菌液用于甘油管中保存在-70 ℃的超低溫冰箱中，采用CASO AGAR+尿素(20 g/L) 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分如下：胰蛋白胨15 g/L,蛋白胨5 g/L,氯化鈉5 g/L,尿素20 g/L,蒸餾水1 000 g/L,瓊脂20g/L(配制固體培養(yǎng)基時需添加)，培養(yǎng)基pH調(diào)至7.3。采用紫外可見光分光光度計(jì)在600 nm波長時的吸光度(OD600)來測定細(xì)胞數(shù)量，本試驗(yàn)使用OD600來表示細(xì)菌濃度，OD600為1.0。

通電過程中的營養(yǎng)液分別由三種鈣源(氯化鈣、硝酸鈣、醋酸鈣)與尿素1∶1等體積混合，調(diào)pH至7.3，菌液與營養(yǎng)液的體積比為1∶15。鈣源為微生物沉積生成碳酸鈣提供鈣源，尿素為微生物生長提供氮源。

1.2 試驗(yàn)方法

為研究不同電壓梯度對巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)碳酸鈣生成量的影響，共設(shè)置四組電壓梯度(0.8、1.0、1.2、1.4 V)以及四個通電時間(10、20、40、80 min)下的3種通電方式(前期通電、后期通電、全程通電)。以通電時長10 min為例，通電試工如下。

前期通電：即先向菌液通電10 min后，吸取1 mL菌液與15 mL緩沖液混合搖勻并靜置，靜置時間等于通電時間。

后期通電：即菌液前期不通電，直接吸取1 mL菌液與15 mL緩沖液混合搖勻一起通電10 min。

全程通電：即菌液先通電10 min，再吸取1 mL菌液與15 mL緩沖液混合搖勻一起通電10 min。

試驗(yàn)裝置如圖1所示，學(xué)生電源用于提供電壓，U形管用于盛裝反應(yīng)液(菌液與緩沖液)，萬用表用于隨時檢測電壓情況。試驗(yàn)完成后生成的碳酸鈣沉淀使用定量濾紙和漏斗過濾出碳酸鈣粉末，然后將U形管與過濾后的濾紙都放入烘箱烘干后稱重，最后算出碳酸鈣的生成量。

圖1 試驗(yàn)裝置

2 電壓對脲酶活性的影響

為了研究電壓對細(xì)菌脲酶活性的影響，首先測定了細(xì)菌脲酶的電導(dǎo)率隨電壓梯度在不同時間下的變化特點(diǎn)，取1 mL菌液，與9 mL 1.1 mol/L尿素溶液混合，用電導(dǎo)率儀測量5 min溶液電導(dǎo)率的變化，所測5 min內(nèi)平均電導(dǎo)率變化值(ms/cm·min)乘以稀釋倍數(shù)(10倍)，即為菌液酶活性(mmol/L·min)。以電壓為橫坐標(biāo)，脲酶活性為縱坐標(biāo)，繪制電壓與脲酶活性關(guān)系曲線，如圖2所示。

圖2 脲酶活性與電壓梯度的關(guān)系

由圖2可知，電壓梯度的大小會影響 MICP 的脲酶活性，在不同通電時間條件下，隨著電壓梯度的增加，脲酶活性均呈現(xiàn)先下降再上升再下降的趨勢，并且均在電壓為1.2 V時，細(xì)菌的脲酶活性最大；而且在相同電壓梯度條件下，細(xì)菌的脲酶活性均在通電時間為20 min時最大。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

以電壓為橫坐標(biāo)，碳酸鈣的生成量為縱坐標(biāo)，繪制氯化鈣為鈣源時，電壓與碳酸鈣的生成量關(guān)系曲線，如圖3所示。

圖3 電壓對氯化鈣為鈣源時碳酸鈣生成量的影響

由圖3可以看出，氯化鈣為鈣源時，不同的通電時間(10、20、40、80 min)條件下，隨著電壓梯度的不同，相同通電方式下碳酸鈣的生成量均呈現(xiàn)先下降再上升再下降的趨勢，在0.8 ～1.0 V時，碳酸鈣的生成量隨電壓的增大而減小，在1.0 ～1.2 V時，碳酸鈣的生成量隨電壓的增大而增大，在1.2 ～1.4 V時，碳酸鈣的生成量隨電壓的增大而減小，但碳酸鈣的生成量均在1.2 V達(dá)到最大，所以最合適的電壓為1.2 V；在相同電壓，不同通電時間條件下，可以看出均在通電時間為20 min時碳酸鈣的生成量最多，所以最佳的通電時間為20 min。

以電壓為橫坐標(biāo)，碳酸鈣的生成量為縱坐標(biāo)，繪制硝酸鈣和醋酸鈣為鈣源時，電壓與碳酸鈣的生成量關(guān)系曲線，如圖4、圖5所示。

圖4 電壓對硝酸鈣為鈣源時碳酸鈣生成量的影響

圖5 電壓對醋酸鈣為鈣源碳酸鈣生成量的影響

由圖4、圖5可以看出其規(guī)律與氯化鈣相似，均是在電壓為1.2 V，通電時間20 min時碳酸鈣的生成量最多。

由于最佳通電時間為20 min，所以以20 min為例，以電壓為橫坐標(biāo)，碳酸鈣的生成量為縱坐標(biāo)，繪制出不同鈣源不同通電方式下，電壓與碳酸鈣的生成量關(guān)系曲線，如圖6所示。

圖6 不同鈣源不同通電方式碳酸鈣生成量與電壓的關(guān)系

由圖6可以看出隨著電壓梯度的增加，相同的通電時間下，前期、后期、全程均呈現(xiàn)先下降再上升再下降的趨勢，但是全程通電碳酸鈣的生成量始終高于前期通電和后期通電，所以最佳通電方式為全程通電。

以20 min為例，以電壓為橫坐標(biāo)，碳酸鈣的生成量為縱坐標(biāo)，繪制出不同鈣源相同通電方式下，電壓與碳酸鈣的生成量關(guān)系曲線，如圖7所示。

圖7 不同通電方式三種鈣源碳酸鈣的生成量與電壓的關(guān)系

由圖7均可以看出氯化鈣為鈣源時，碳酸鈣的生成量始終高于硝酸鈣和醋酸鈣為鈣源時的生成量，所以最優(yōu)鈣源為氯化鈣。

綜上所述，最適電壓為1.2 V，最佳通電方式為全程通電，最佳通電時間為20 min，最佳鈣源為氯化鈣。說明適宜的電壓能夠促進(jìn)巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)生成碳酸鈣沉淀。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是由于適宜的電壓能夠?qū)Π褪涎挎邨U菌的生物活性起促進(jìn)作用，提高其脲酶活性，進(jìn)而加速尿素水解加快微生物的成礦作用，最終提高碳酸鈣的產(chǎn)量。

4 微細(xì)觀分析

用金相顯微鏡觀測不同鈣源與巴氏芽孢桿菌混合作用后生成碳酸鈣沉淀的表面形態(tài)，如圖8所示。

圖8 不同鈣源生成碳酸鈣沉淀的表面結(jié)構(gòu)

將生成的碳酸鈣粉末過濾在濾紙中，將濾紙放在培養(yǎng)皿中，放入電熱恒溫干燥箱中烘干，烘干后取出適量碳酸鈣粉末放在載玻片上用金相顯微鏡觀測其表面結(jié)構(gòu)。

圖8(a)是以氯化鈣作為鈣源，利用巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)生成的碳酸鈣沉淀。氯化鈣營養(yǎng)鹽所生成的碳酸鈣沉淀為絮狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)孔隙大，較為松軟。

圖8(b)是以硝酸鈣作為鈣源，利用巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)生成的碳酸鈣沉淀。從生成的碳酸鈣沉淀可以看出硝酸鈣營養(yǎng)鹽在巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)下生產(chǎn)的碳酸鈣沉淀為石榴狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)由一個個細(xì)小的球形顆粒粘結(jié)成，該結(jié)構(gòu)膠結(jié)性能較差。

圖8(c)是以硝酸鈣作為鈣源，利用巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)生成的碳酸鈣沉淀。從生成的碳酸鈣沉淀可以看出醋酸鈣營養(yǎng)鹽在脲酶菌誘導(dǎo)下生成的碳酸鈣沉淀為明顯的板狀結(jié)構(gòu)伴隨有少量顆粒狀結(jié)構(gòu)。細(xì)小的顆粒狀碳酸鈣在生成的過程中逐漸凝聚成有一定厚度的板狀固體。

因此，后續(xù)將針對不同鈣源微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀固化黏性土進(jìn)行試驗(yàn)，以進(jìn)一步探究微生物固化對黏性土力學(xué)特性影響的內(nèi)在機(jī)理。

5 結(jié)論

利用微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀技術(shù)，研究在溶液環(huán)境下不同電壓梯度、不同通電時間和不同通電方式對于巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)不同鈣源產(chǎn)生碳酸鈣沉積的影響規(guī)律，得到如下結(jié)論。

(1)適宜的電壓能夠?qū)Π褪涎挎邨U菌的生物活性起促進(jìn)作用，提高脲酶活性，而脲酶活性的提高又加快了尿素的水解，從而加快了微生物的成礦作用，最終提高了碳酸鈣的產(chǎn)量。

(2)通電方式上對促進(jìn)巴氏芽孢桿菌生成碳酸鈣最有利的是全程通電；最佳通電電壓為1.2 V；最優(yōu)通電時間為20 min。

(3)在相同通電時間，相同通電方式條件下比較三種鈣源，發(fā)現(xiàn)氯化鈣為鈣源時，碳酸鈣的生成量最多，所以最佳鈣源為氯化鈣。