方 偉，余 曉，王 晶，徐秋芳，梁辰飛，秦 華，陳俊輝

（浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州311300）

山核桃Carya cathayensis是中國(guó)特有的珍貴干果。近年來(lái)，山核桃造林面積快速增加，大量施用農(nóng)藥化肥和人為過(guò)度經(jīng)營(yíng)，山核桃根腐病的發(fā)生面積也逐步增大，導(dǎo)致根腐病和干腐病日益嚴(yán)重，造成山核桃林下植被破壞、土壤肥力和pH值下降[1]，給農(nóng)戶造成重大經(jīng)濟(jì)損失。研究者對(duì)山核桃干腐病和根腐病病原菌進(jìn)行分離鑒定[2-4]，證明干腐病的發(fā)生與子囊菌門(mén)葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae葡萄座腔菌屬Botryosphaeria真菌有著密切聯(lián)系[5]，根腐病主要病原菌是尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum[6]。土壤酸化、根系腐爛是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)連作障礙的常見(jiàn)現(xiàn)象[7-8]，也是土壤微生物區(qū)系失衡，真菌比例增加的主要原因[9-11]。因此，提高土壤pH值是解決連作障礙的重要手段之一。大量研究表明：在酸性土壤中施用生石灰可提高土壤pH值，調(diào)節(jié)土壤微生物的數(shù)量、分布和組成，對(duì)植物的生理機(jī)能有較好的促進(jìn)和改善作用[12-13]。同時(shí)，添加有益微生物及菌劑型生物肥料也是改善退化土壤微生物區(qū)系的措施之一。楊星[14]研究發(fā)現(xiàn)：施用微生物肥料能提高土壤微生物多樣性和抑制病原菌的生長(zhǎng)；土壤中添加哈茨木霉菌Trichoderma harzianum對(duì)辣椒Capsicum annuum、馬鈴薯Solanum tuberosum、黃瓜Cucumis sativus、花生Arachis hypogaea、白菜Brassica pekinensis等抗病實(shí)驗(yàn)表明：哈茨木霉菌對(duì)多種農(nóng)作物有促生和抗病效應(yīng)[15-17]。而芽孢桿菌Bacillus作為一種生防菌對(duì)果樹(shù)病原菌有較好的抑制效果，其抑制作用是通過(guò)菌體及其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)或分泌水解酶（蛋白酶和纖維素酶）實(shí)現(xiàn)的[18]。然而，益生菌在生產(chǎn)中的應(yīng)用效果差異很大。許多有益菌株在實(shí)驗(yàn)室研究效果很好，但應(yīng)用到大田土壤中則因?yàn)殡y以與土著微生物競(jìng)爭(zhēng)，很難在土壤中長(zhǎng)期發(fā)揮其作用。為了解決山核桃林地土壤退化、山核桃干腐病和根腐病等問(wèn)題，本研究以解淀粉芽孢桿菌為對(duì)象，設(shè)計(jì)了提高土壤pH值、添加有益菌、施用有益菌菌肥等3種調(diào)控措施，應(yīng)用定量PCR以及PCR-DGGE技術(shù)，監(jiān)測(cè)調(diào)控措施對(duì)土壤細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的影響以及添加的有益菌在土壤中的存活時(shí)間。研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)目標(biāo)菌種及其肥料的應(yīng)用具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

1.1.1 盆栽土壤與實(shí)驗(yàn)材料 試驗(yàn)土壤為浙江省杭州市臨安區(qū)湍口鄉(xiāng)的山核桃林地石灰?guī)r土壤。采樣深度為0～30 cm，屬陽(yáng)面山地干腐病和根腐病較嚴(yán)重的山核桃林地土壤，常規(guī)施用肥料為氨基酸復(fù)混肥料（河南蓮花味精股份有限公司），磷、氮、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%。每年施3次肥，每次用量2 kg·株-1，施肥時(shí)間為每年9-10月及3月底和6月。土壤基本理化性質(zhì)：pH 6.2，有機(jī)質(zhì)16.51 g·kg-1，堿解氮132.20 mg·kg-1， 有效磷 5.81 mg·kg-1， 速效鉀 116.60 mg·kg-1。

3種土壤調(diào)節(jié)材料分別為：①石灰石粉末（CaCO3），采自當(dāng)?shù)氐氖沂V區(qū)；②芽孢桿菌發(fā)酵液為浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期篩選的具有抑制核桃干腐病的芽孢桿菌（菌種保藏號(hào)： CGMCC11640）， 發(fā)酵液所含養(yǎng)分為氮 0.236 mg·L-1， 磷 516.960 mg·L-1， 鉀 39.000 mg·L-1， 鈣 2.310 mg·L-1， 鎂 1.680 mg·L-1， 鐵 0.077 mg·L-1， 銅 0.002 mg·L-1， 鋅 0.067 mg·L-1， 硼 0.092 mg·L-1。 pH 6.82。③復(fù)合微生物肥料（江陰市聯(lián)業(yè)生物公司提供），肥料含有芽孢桿菌和哈茨木霉2種有益菌，pH值6.50，總有效活菌數(shù)為（菌落形成單位）0.56×108g-1，養(yǎng)分：氮29.6 g·kg-1，五氧化二磷64.2 g·kg-1，氧化鉀 11.0 g·kg-1， 有機(jī)質(zhì) 456.7 g·kg-1， 可溶性氨基酸 15.0 g·kg-1。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 土壤培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：①無(wú)添加的對(duì)照（ck）；②添加2.5%（w/w）石灰石粉（LP）；③添加芽孢桿菌發(fā)酵液（SL）；④添加2%（w/w）復(fù)合微生物肥料（MCF）。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。稱取過(guò)2 mm篩風(fēng)干土壤4.60 kg于花盆（高26 cm，徑24 cm）中，將各個(gè)處理加入的材料混合均勻，用蒸餾水調(diào)節(jié)土壤含水量到田間持水量的30%。菌液處理量取450 g發(fā)酵液與水混合，保證與其他處理的水分相等。培養(yǎng)試驗(yàn)開(kāi)始于2016年11月15日，用塑料薄膜封蓋防止水分蒸發(fā)過(guò)快，同時(shí)，隔2 d對(duì)沙床補(bǔ)充水分，保證沙子的濕度。盆栽進(jìn)行過(guò)程中定期稱量補(bǔ)水，保持盆栽水分含量恒定。培養(yǎng)周期為120 d。

1.1.3 樣品采集與分析 在培養(yǎng)開(kāi)始后20、40、60、120 d進(jìn)行土壤采集，土樣采集深度為5～10 cm，土壤混勻分2份，1份自然風(fēng)干過(guò)1 mm和0.149 mm土壤篩，用于測(cè)土壤化學(xué)指標(biāo)：土壤pH（m水∶m土=2.5∶1.0）； 有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀-硫酸外加熱法[19]； 堿解氮用堿解擴(kuò)散法[19]； 有效磷用碳酸氫鈉（NaHCO3）浸提后鉬銻抗比色法測(cè)定[19]；速效鉀用醋酸銨浸提然后使用火焰光度計(jì)測(cè)定[19]。另一份土壤經(jīng)冷凍干燥處理，使用DNA提取試劑盒提取土壤總DNA，用作分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 分析方法

1.2.1 土壤總DNA的提取和rDNA的PCR擴(kuò)增 稱取0.50 g凍干土提取總DNA，使用提取試劑盒Power SoiDNA Isolation Kit（Mo Bio,美國(guó)）； Bovine Serum Albumin（BSA， 20 g·L-1,TaKaRa,中國(guó)大連）；Goldview（SBS,中國(guó)上海）；熒光染料SYBR green I（Invitrogen,美國(guó)）；質(zhì)粒提取試劑盒,SYBRPremix Ex TaqTM（Takara,中國(guó)大連）；引物由上海生物工程有限公司合成。DNA提取方法按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，提取的DNA片段經(jīng)10 g·L-1的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定[20]（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer,美國(guó)），DNA樣品分裝并保存于-40℃冰箱。

PCR 用 50 μL 反應(yīng)體系： 10×Premix Taq 25.00 μL， 引物各 0.50 μL， 模板 DNA 0.75 μL， 0.50 μL BSA（20 g·L-1）， 用滅菌超純水補(bǔ)足至 50.00 μL（PCR 引物見(jiàn)表 1.2）。 擴(kuò)增程序參考趙天心等[20]， 反應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照組，經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用Goldview染色，確認(rèn)其片段大小，保存在-20℃，用于變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。

1.2.2 DGGE染色及凝膠成像分析 使用D-Code TM Universal Mutation Detection System（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行DGGE分析，方法參考趙天心等[20]。在體積分?jǐn)?shù)為6%的聚丙烯酰胺和變性梯度40%～60%（V/V）的凝膠上進(jìn)行電泳[100%變性膠含有7 mol·L-1尿素和40%（V/V）甲酰胺]，膠厚度為1 mm，電泳緩沖液為1×TAE，取10.0 L第2輪PCR產(chǎn)物與10.0 L 6×loading buffer混勻后用微量進(jìn)樣器加樣，在60℃和80 V條件下電泳 13 h[20-21]。

1.2.3 DGGE譜圖分析 電泳結(jié)束后，凝膠使用SYBR green I（1∶10 000）染料染色30 min后在 Gel DocTM EQ凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）拍照并保存，利用Quantity One 4.6.2（Bio-Rad，美國(guó)）軟件對(duì)圖進(jìn)行數(shù)字化分析。條帶的數(shù)目表明樣品的基因型豐富度（Ggenotypic richness，S）[22]，用Quantity One軟件檢測(cè)條帶的相對(duì)亮度即為該基因型的相對(duì)多度（Pi）[23]。用基因型豐富度、多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index，H′）和Pielou均勻度指數(shù)（Pielou evenness index，E）表征土壤微生物群落的基因型多樣性（genotypic genotypic diversity）特征。

1.2.4 土壤細(xì)菌真菌豐度-實(shí)時(shí)熒光定量 PCR用土壤總DNA作為模板，F(xiàn)R1、FF390（真菌）和338F、 518R（細(xì)菌）為引物（表 1）， 20.0 μL 反應(yīng)體系[20]： 2×SYBR Premix Ex TaqTM10.0 μL， 上下游引物各0.2 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌超純水補(bǔ)足20.0 μL，每個(gè)樣品3次重復(fù)，反應(yīng)程序具體如下：真菌，預(yù)變性95℃3 min；變性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，最后72℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)；溶解曲線過(guò)程（65℃到95℃，0.5℃·s-1）；細(xì)菌，預(yù)變性95℃ 3 min；變性95℃ 30 s，退火56℃30 s，最后72℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)；溶解曲線過(guò)程（65℃到95℃，0.5℃·s-1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用已知種屬的陽(yáng)性克隆子擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，檢測(cè)其濃度和純度[D（260）/D（280）]后，將質(zhì)粒以10倍梯度稀釋（10-3～10-8），作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，計(jì)算細(xì)菌真菌的基因拷貝數(shù)[26]。反應(yīng)程序和體系反應(yīng)體系同上。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers used for PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)分析

圖表使用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各處理間比較采用One-way ANOVA分析，差異顯著性分析用Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（P＜0.05）。DGGE圖譜參考余曉等[21]方法用Quantity One軟件數(shù)字化，用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）、豐富度指數(shù)（D）以及均勻度指數(shù)（E）對(duì)土壤細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行分析[27]。其計(jì)算公式分別為：

式（1）～（3）中：ni為每條電泳條帶光密度峰值，N是同一泳道中所有條帶光密度峰值的總和，S為每一泳道總共的條帶數(shù)。光密度峰值通過(guò)Quantity One軟件分析獲取[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同調(diào)控措施對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

表2比較了4個(gè)處理在120 d培養(yǎng)周期中對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響。在培養(yǎng)周期中，從各指標(biāo)結(jié)果來(lái)看，LP處理顯著提高了土壤pH值和土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（P＜0.05），但對(duì)土壤其他養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著影響。MCF處理在120 d時(shí)顯著（P＜0.05）降低了土壤pH值，MCF、SL處理與ck顯著（P＜0.05）提高了土壤有機(jī)質(zhì)和土壤有效磷，同時(shí)MCF處理也顯著（P＜0.05）提高了土壤堿解氮和速效鉀，MCF處理降低了土壤pH值（6.29～5.34），而SL處理提高了土壤pH值。

表2 不同調(diào)控措施對(duì)土壤養(yǎng)分的影響Table 2 Effects of different treatments on soil nutrients

2.2 不同調(diào)控措施對(duì)土壤細(xì)菌和真菌豐度影響

2.2.1 調(diào)控措施對(duì)土壤細(xì)菌豐度的影響 120 d培養(yǎng)過(guò)程中土壤細(xì)菌豐度變化如圖1。從隨培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌豐度變化來(lái)看，4種處理土壤細(xì)菌豐度總體呈下降趨勢(shì)。SL處理細(xì)菌數(shù)量呈先增加再減少趨勢(shì)，在20 d時(shí)與MCF處理差異不顯著，20 d后SL處理和其他3種處理比較都存在顯著差異（P＜0.05），在40 d達(dá)到最高6.02×108g-1。MCF處理細(xì)菌豐度在20 d時(shí)高于其他3種處理，培養(yǎng)過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，60 d后和ck比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。LP處理在20～60 d均提高了土壤細(xì)菌豐度，120 d時(shí)和ck比較差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明：SL處理在整個(gè)培養(yǎng)周期中顯著（P＜0.05）提高了土壤細(xì)菌數(shù)量，MCF處理在20～40 d顯著（P＜0.05）提高了土壤細(xì)菌數(shù)量，LP處理在60 d顯著（P＜0.05）提高了土壤細(xì)菌數(shù)量。

2.2.2 不同調(diào)控措施對(duì)土壤真菌豐度的影響 120 d培養(yǎng)過(guò)程中土壤真菌豐度變化如圖2所示：在整個(gè)培養(yǎng)周期中，4種處理真菌基因拷貝數(shù)呈先上升再下降趨勢(shì)。MCF處理的土壤真菌豐度在4個(gè)時(shí)期高于其他處理且有顯著差異（P＜0.05），在40 d時(shí)真菌基因拷貝數(shù)達(dá)最高，為8.73×107g-1。與ck相比，SL處理的土壤真菌拷貝數(shù)在20～60 d顯著增加（P＜0.05），LP處理的土壤僅在40 d時(shí)高于ck，有顯著差異（P＜0.05），其他時(shí)期無(wú)明顯差異。

圖1 不同調(diào)控措施下土壤細(xì)菌豐度的動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Dynamics of soil bacteria abundance with different treatments

圖2 不同調(diào)控措施下土壤真菌豐度的動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamics of soil fungi abundance with different treatments

2.3 不同調(diào)控措施對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性影響

2.3.1 不同調(diào)控措施對(duì)土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)的影響 對(duì)4次采集的土壤細(xì)菌進(jìn)行PCR-DGGE分析（圖3），不同的條帶代表不同的細(xì)菌基因片段，每個(gè)泳道中條帶的亮度反映出細(xì)菌相對(duì)生物量的多少。首先對(duì)培養(yǎng)20 d土壤DNA進(jìn)行PCR-DGGE，將幾個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶割膠，用相同的引物擴(kuò)增，用作定位標(biāo)記（Marker），目的是分析這些優(yōu)勢(shì)條帶的動(dòng)態(tài)變化，再分析不同培養(yǎng)時(shí)間土壤細(xì)菌的DGGE。結(jié)果表明：培養(yǎng)20 d時(shí)，不同處理?xiàng)l帶存在差異，但同一處理3個(gè)重復(fù)之間相似度很好，說(shuō)明培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)控制良好。所有處理有3條較亮的共性條帶（條帶1、4、6），條帶6不受處理影響，而條帶1則是菌液處理亮度反而最弱，條帶4則是復(fù)合微生物肥料處理稍微弱一點(diǎn)。個(gè)性條帶分析發(fā)現(xiàn)，條帶5最亮，該條帶由目標(biāo)菌——芽孢桿菌WK1產(chǎn)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)合微生物肥料處理土壤其條帶5的亮度比對(duì)照和石灰石粉處理高。條帶2是石灰石粉處理的特征條帶，但培養(yǎng)到40 d時(shí)，菌液處理也出現(xiàn)條帶2。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，大部分條帶變化不大，而作為菌液的優(yōu)勢(shì)條帶5在菌液處理在120 d之內(nèi)一直保持最強(qiáng)亮度，說(shuō)明添加的芽孢桿菌能很好地與土壤微生物競(jìng)爭(zhēng)而繁殖生長(zhǎng)，但發(fā)現(xiàn)條帶5的位置在40 d時(shí)出現(xiàn)新的條帶，推測(cè)新條帶與原條帶的間隔隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，因?yàn)镻CR-DGGE的條件完全相同，推測(cè)可能是原土壤存在的菌，因生長(zhǎng)狀況良好，而被優(yōu)先擴(kuò)增出來(lái)。根據(jù)細(xì)菌PCR-DGGE圖譜中條帶位置和亮度的數(shù)值化結(jié)果，計(jì)算得細(xì)菌的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)（表3）。多樣性指數(shù)越大表示微生物群落多樣性越高，均勻度指數(shù)說(shuō)明不同物種的數(shù)量均等程度，豐富度指數(shù)高則說(shuō)明物種數(shù)目多。多樣性指數(shù)結(jié)果分析表明：ck處理多樣性指數(shù)在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中高于其他處理，60 d之前顯著（P＜0.05）高于SL和MCF處理，說(shuō)明添加菌液、施用微生物肥料降低了細(xì)菌的生物多樣性；LP處理在前40 d時(shí)與對(duì)照持平，60 d時(shí)顯著（P＜0.05）低于對(duì)照，但高于（P＜0.05）菌液和復(fù)合微生物肥料處理。不同處理之間豐富度指數(shù)差異變化規(guī)律與多樣性指數(shù)一致。SL處理土壤細(xì)菌均勻度指數(shù)和其他3種處理相比，存在顯著差異（P＜0.05），而LP、MCF和ck等3種處理間細(xì)菌均勻度指數(shù)沒(méi)有差異。

2.3.2 不同調(diào)控措施對(duì)土壤真菌結(jié)構(gòu)的影響 土壤真菌的PCR-DGGE結(jié)果表明：復(fù)合微生物肥處理后，其真菌DGGE圖譜結(jié)構(gòu)明顯不同于其他3個(gè)處理（圖4），所有處理和培養(yǎng)時(shí)間有3條優(yōu)勢(shì)共性條帶（條帶1、5、8），培養(yǎng)20 d時(shí)復(fù)合微生物肥料土壤條帶1的亮度低于其他3個(gè)處理，但40 d以后亮度差異消失。微生物肥料處理有5個(gè)特征條帶（條帶2、3、4、6和7），這些特征條帶在前60 d時(shí)變化不大，但第120天時(shí)只剩下條帶2，其余基本消失或非常弱。而且培養(yǎng)120 d時(shí)所有條帶亮度均較低，說(shuō)明此時(shí)土壤真菌的總體數(shù)量下降明顯。對(duì)真菌的PCR-DGGE圖譜進(jìn)行Shannon-Wiener指數(shù)分析（表4）：20 d時(shí)LP處理和SL處理有顯著性差異（P＜0.05），但培養(yǎng)20 d時(shí)LP處理的土壤真菌多樣性和豐富度指數(shù)高于其他3種處理，40～120 d期間添加菌液處理的土壤真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)在各個(gè)時(shí)期低于其他處理。MCF處理的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)在20 d時(shí)低于ck，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖3 不同調(diào)控措施下土壤中細(xì)菌群落在不同時(shí)間下的DGGE圖譜Figure 3 DGGE fingerprinting of bacteria in soils with different treatments and time experiment

表3 不同調(diào)控措施下土壤細(xì)菌群落多樣性分析Table 3 Biodiversity indices of soil bacteria in the soils with different treatments

3 討論

圖4 不同調(diào)控措施下土壤中真菌群落在不同時(shí)間下的DGGE圖譜Figure 4 DGGE fingerprinting of fungi in soils with different treatments and time experiment

表4 不同調(diào)控措施下土壤真菌群落多樣性分析Table 4 Biodiversity indices of soil fungi with different treatments and experiment time

土壤微生物的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化是反映土壤總微生物活性的一個(gè)重要參數(shù)，與土壤質(zhì)量、健康狀況和生產(chǎn)力密切相關(guān)。近些年，隨生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展和社會(huì)對(duì)環(huán)境保護(hù)的日益重視，不斷深入研究林地連作障礙，并積極研發(fā)新型肥料（尤其是菌肥）來(lái)替代農(nóng)藥和化肥[28]成為熱點(diǎn)。逄煥成等[29]用微生物菌劑處理土壤，使土壤速效鉀、堿解氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)分別提高了28.9%、50.2%、71.4%和55.9%。本研究表明：4種處理對(duì)土壤理化性質(zhì)影響有所不同，施用菌液和微生物肥料2種處理均提高了土壤速效養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但對(duì)于土壤肥效的提高表現(xiàn)為前期大于后期。石灰石粉對(duì)土壤養(yǎng)分無(wú)顯著提高作用，對(duì)土壤pH值的調(diào)控效果最快，能顯著提高土壤pH值，達(dá)到山核桃生長(zhǎng)的理想范圍，而該地常用生石灰調(diào)節(jié)土壤酸度，可以短期內(nèi)提高土壤pH值，但對(duì)植物根系以及土壤微生物有很大傷害[30]，常發(fā)生因施用不均勻引發(fā)局部土壤強(qiáng)堿現(xiàn)象，不適合人工翻耕的山地土壤。因此，對(duì)于林地土壤酸度調(diào)節(jié)而言，施用石灰石粉不僅比傳統(tǒng)的生石灰效果更好、經(jīng)濟(jì)成本低，而且持久效果更好，長(zhǎng)達(dá)4 a以上[31]。復(fù)合微生物肥可調(diào)節(jié)土壤酸度，顯著降低土壤pH值，可能是施入土壤后肥料中的有機(jī)質(zhì)礦化以及氮的硝化作用造成。因此，施用菌液和復(fù)合微生物肥料能顯著改善土壤理化性狀，對(duì)科學(xué)合理施肥，提高山核桃林地土壤質(zhì)量有極其重要指導(dǎo)意義。

本研究表明：不同處理細(xì)菌基因拷貝數(shù)達(dá)108g-1左右，真菌基因拷貝數(shù)達(dá)106～107g-1，低于辜運(yùn)富等[32]在植煙土壤測(cè)定的基因拷貝數(shù)，可能是2種作物土壤性質(zhì)差異造成的。石灰石粉處理對(duì)細(xì)菌的豐度作用不明顯，只在施用后60 d時(shí)高于對(duì)照（P＜0.05）。由于生產(chǎn)上有施用生石灰調(diào)節(jié)pH值的措施，所以本底土壤pH值呈微酸性（6.29）。一般認(rèn)為：中性土壤有利于細(xì)菌繁殖。本研究中施用石灰石粉提高土壤pH值至8.0以上對(duì)土壤細(xì)菌豐度無(wú)顯著促進(jìn)作用。菌液處理40 d時(shí)土壤細(xì)菌豐度最高，短期施用菌液和復(fù)合微生物肥料顯著提高了細(xì)菌和真菌數(shù)量，和胡可等[33]、康萍芝等[34]研究結(jié)果一致。原因是菌液和復(fù)合微生物肥料含有大量養(yǎng)分，為細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)提供了豐富的碳源和能源，同時(shí)菌液和復(fù)合微生物肥料本身含有大量添加的菌種。40 d后復(fù)合微生物肥處理真菌豐度下降幅度較大，可能是真菌對(duì)復(fù)雜有機(jī)碳的依賴性比細(xì)菌強(qiáng)，肥料中添加有哈茨木霉，該菌前期生長(zhǎng)繁殖快，成為優(yōu)勢(shì)菌種，40 d時(shí)大部分復(fù)雜的有機(jī)碳被微生物分解利用，導(dǎo)致真菌下降幅度較大[35]。

土壤微生物群落多樣性提高不僅能促進(jìn)土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，而且能延緩?fù)寥牢⑸锷鷳B(tài)環(huán)境的惡化[36]。高雪蓮等[37]通過(guò)DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：施用生物有機(jī)肥后甜瓜Cucumis melo根際細(xì)菌和放線菌的數(shù)目明顯高于對(duì)照土壤，病原菌和真菌數(shù)量迅速減少。本研究中，DGGE圖譜表明不同處理土樣間大部分條帶相似，細(xì)菌和真菌DGGE圖譜中菌液處理?xiàng)l帶減少，細(xì)菌DGGE圖譜出現(xiàn)顏色較深條帶（條帶5），說(shuō)明施用菌液抑制其他菌落生長(zhǎng)，增加了土壤優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量，改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。復(fù)合微生物肥料處理的細(xì)菌DGGE圖譜中，僅條帶5顏色較其他條帶深，其他條帶無(wú)明顯變化，而真菌DGGE圖譜條帶數(shù)減少，4條帶顏色較深，說(shuō)明施用復(fù)合微生物肥料能增加有益菌數(shù)量，抑制土壤中其他真菌的生長(zhǎng)。也有研究證實(shí)：向土壤添加有益菌，能有效改善土壤肥力，抑制病原菌，增加微生物群落多樣性和提高植株抗病能力[38-40]。對(duì)DGGE圖譜信息的多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，添加菌液后土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)下降，與游偲等[41]結(jié)果相反?？赡艿脑蛑皇峭饧拥木鷶?shù)量增加明顯，抑制了某些土著細(xì)菌的生長(zhǎng)[42]。原因之二是外加的菌數(shù)量增加明顯，擴(kuò)大了多樣性指數(shù)計(jì)算公式的分母。復(fù)合微生物肥料處理的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)明顯低于對(duì)照，真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)無(wú)顯著變化，李朔[43]和吳恩彪[44]研究得出施用微生物肥料能增加土壤微生物的多樣性的結(jié)果不一致，原因是他們的微生物肥料中含有多種微生物，而本研究使用的復(fù)合微生物肥料只含有哈茨木霉和芽孢桿菌2種菌。

4 結(jié)論

添加石灰石粉能顯著提高山核桃林地土壤pH值，施用菌液能提高土壤pH值和有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并能顯著提高土壤細(xì)菌數(shù)量，復(fù)合微生物肥料對(duì)提高林地土壤有機(jī)質(zhì)和有效養(yǎng)分效果最好，顯著提高土壤真菌豐度，短期提高土壤細(xì)菌數(shù)量，因此菌液、復(fù)合微生物肥和石灰石粉可明顯改良山核桃林地土壤化學(xué)性狀和提高土壤有益菌數(shù)量，可作為山核桃林地土壤改良劑。