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        中國(guó)人群傳染性單核細(xì)胞增多癥患者抗EB病毒抗體陽性檢出率的Meta分析

        2020-04-21 03:10:14張敏杰高玉芳楊飛飛徐曉莉
        檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2020年3期
        關(guān)鍵詞:血清分析檢測(cè)

        張敏杰, 高玉芳, 楊飛飛, 徐曉莉

        (咸陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,陜西 咸陽 712000)

        EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)通常是在嬰兒期或幼兒期通過與家人親近接觸而獲得感染,幼年時(shí)期原發(fā)感染EBV致病較輕或不致病,青少年感染EBV可導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectious mononucleosis,IM)。IM的典型臨床癥狀包括發(fā)熱、咽峽炎、頸部淋巴結(jié)病及乏力,病情逐漸加重,病程持續(xù)1~6周后可自然消退[1]。由于EBV原發(fā)感染的病毒學(xué)及免疫學(xué)機(jī)制尚未被闡明,因此僅癥狀典型的病例會(huì)引起臨床關(guān)注。然而,IM通常在EBV經(jīng)口傳播后的5~7周才會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀。此時(shí),咽漱液中已經(jīng)可以檢測(cè)到高水平的EBV,表明EBV已經(jīng)在上皮細(xì)胞或口咽表面的B細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂解復(fù)制[2-3]。同時(shí),EBV通過潛伏感染傳播到B細(xì)胞池,此時(shí)可在扁桃體淋巴組織和血液中發(fā)現(xiàn)大量潛伏感染的B細(xì)胞,隨后病毒進(jìn)入循環(huán)記憶B細(xì)胞[4]。病毒感染周期與免疫反應(yīng)過程一致[5],因此可通過血清學(xué)檢測(cè)EBV裂解復(fù)制周期表達(dá)產(chǎn)物——EB病毒衣殼抗原(Epstein-Barr virus viral capsid antigen,EBV-VCA)的IgM抗體及高滴度的IgG抗體診斷IM,此時(shí)潛伏感染狀態(tài)下EBV表達(dá)產(chǎn)物——EB病毒核抗原(Epstein-Barr virus nuclear antigen,EBV-NA) IgG抗體會(huì)缺失[1]。為了探索我國(guó)IM患者與對(duì)照者血清中各種EBV抗體的陽性檢出率,本研究擬通過檢索對(duì)我國(guó)IM患者及對(duì)照者血清中各種EBV抗體進(jìn)行檢測(cè)的病例-對(duì)照研究,并進(jìn)行Meta分析,為臨床癥狀不典型IM患者的早期診斷提供數(shù)據(jù)支持。

        1 材料和方法

        1.1 資料來源及文獻(xiàn)檢索策略

        檢索中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、萬方科技期刊全文數(shù)據(jù)庫、Pubmed、EMbase、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)庫(Chinese Biological Medicine Database,CBM)和維普中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(Chinese Weipu Database,VIP)中公開發(fā)表的,對(duì)我國(guó)IM患者血清中抗EBV抗體進(jìn)行檢測(cè)的病例-對(duì)照研究,檢索時(shí)限從建庫到2018年2月。中文檢索主題詞為“傳染性單核細(xì)胞增多癥”或“IM”、“EB病毒”或“皰疹病毒4”,英文檢索詞為“infectious mononucleosis”或“IM”、“Epstein-Barr virus”或“herpesvirus 4”。同時(shí)手工檢索其他相關(guān)文獻(xiàn)以及納入研究的參考文獻(xiàn),以補(bǔ)充獲取更多文獻(xiàn)。

        1.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

        文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn):(1)文獻(xiàn)類型為設(shè)計(jì)合理的以我國(guó)IM患者為觀察對(duì)象的病例-對(duì)照研究;(2)對(duì)IM患者和對(duì)照者血清中抗EBV抗體(IgM/IgG/IgA)進(jìn)行檢測(cè),并明確抗原類型如EBV-VCA、EB病毒早期抗原(Epstein-Barr virus early antigen,EBEA)或EBV-NA;(3)病例均為IM患者或診斷符合IM的診斷標(biāo)準(zhǔn);(4)數(shù)據(jù)完整或根據(jù)研究結(jié)果能推算出所需數(shù)據(jù)。

        文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn):(1)關(guān)于IM與EBV的病例報(bào)道、臨床癥狀分析、綜述、無法獲取全文的會(huì)議內(nèi)容的摘要等;(2)未指明所測(cè)抗EBV抗原類型的研究或?qū)BV重組體進(jìn)行抗體檢測(cè)的研究;(3)觀察對(duì)象擬診斷為IM患者或者疑似IM患者的研究;(4)非人類研究、無血清學(xué)數(shù)據(jù)或血清學(xué)研究結(jié)果不明確的研究;(5)同一作者或研究單位對(duì)同一人群進(jìn)行的重復(fù)研究或重復(fù)發(fā)表、重復(fù)收錄的研究。文獻(xiàn)篩選過程見圖1。

        1.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

        圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

        采用紐卡斯?fàn)?渥太華量表(Newcastle-Ottawa scale,NOS)對(duì)納入的研究進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。分別從研究人群的選擇、組間可比性及暴露因素的測(cè)量3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究人群的選擇標(biāo)準(zhǔn)占4分,包括4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn):(1)IM的診斷方法符合診斷標(biāo)準(zhǔn)占1分,文章中未指明診斷標(biāo)準(zhǔn),但表明臨床診斷為IM也可得1分;(2)連續(xù)收集且具有代表性的病例占1分;(3)同一時(shí)期收集的健康對(duì)照占1分;(4)明確說明對(duì)照有無疾病史的占1分。組間可比較性標(biāo)準(zhǔn)占2分,包括2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn):(1)對(duì)照組與病例組年齡相匹配占1分,年齡不詳?shù)牟坏梅?;?)除年齡外性別相匹配占1分。為了方便對(duì)血清學(xué)研究進(jìn)行分析,本研究修改了暴露評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),共占4分,包括4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn):(1)病例組與對(duì)照組均采用雙盲分析占1分;(2)明確說明試劑來源占1分;(3)血清陽性Cut-off值明確占1分;(4)病例組與對(duì)照組檢測(cè)方法相同占1分。修改后的NOS滿分為10分。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用Rev Man 5.3軟件和Stata 12軟件進(jìn)行Meta分析并生成森林圖。研究中提取的數(shù)據(jù)以中值(最小值~最大值)表示。計(jì)數(shù)資料以比值比(odds ratio,OR)及95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)為效應(yīng)量指標(biāo)。采用異質(zhì)性指標(biāo)I2評(píng)估納入研究之間的異質(zhì)性。當(dāng)I2≤50%時(shí),表明研究間不存在異質(zhì)性,以固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析;當(dāng)I2>50%時(shí),表明各研究之間異質(zhì)性較大,采用隨機(jī)效應(yīng)模型。異質(zhì)性較大時(shí)進(jìn)行亞組分析,找出異質(zhì)性來源。分別按研究質(zhì)量、對(duì)照類型選擇、檢測(cè)方法、病例與對(duì)照年齡是否匹配進(jìn)行分組并作分析,通過比較各亞組OR值尋找引起異質(zhì)性的潛在原因。采用Egger檢驗(yàn)評(píng)估納入研究是否存在發(fā)表偏移,P>0.05表明不存在發(fā)表偏移。逐一剔除對(duì)不同抗原抗體進(jìn)行檢測(cè)的研究,以分析敏感性來判斷結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

        2 結(jié)果

        2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果及納入研究的基本情況

        由本研究的2名作者分別按照檢索策略檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫,初檢共獲得相關(guān)文獻(xiàn)783篇,以納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)篩選、資料提取和質(zhì)量評(píng)估,隨后進(jìn)行結(jié)果對(duì)比。存在爭(zhēng)議的文獻(xiàn)由第3位作者和第4位作者協(xié)商決定。最終納入16篇文獻(xiàn)[6-21],其中15篇中文文獻(xiàn)、1篇英文文獻(xiàn)。IM組樣本量為54(14~256)例,對(duì)照組樣本量為46(10~256)例。累計(jì)IM組1 305例,對(duì)照組973例。納入研究的基本信息見表1。

        2.2 納入研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)

        根據(jù)修改后的NOS,賴書臺(tái)[10]的研究的病例獲得最高分8分,16項(xiàng)研究總體得分為6(3~8)分。根據(jù)病例與對(duì)照選擇標(biāo)準(zhǔn),16項(xiàng)研究的病例均為IM患者或臨床診斷為IM的患者,10項(xiàng)研究[6-11,13-14,17-18]選擇健康體檢者作為對(duì)照,但僅有1項(xiàng)研究明確說明對(duì)照無疾病史[10],其余6項(xiàng)研究選擇“普通發(fā)熱”、“上呼吸道感染”、“非IM其他患者”為對(duì)照。根據(jù)組間可比較性標(biāo)準(zhǔn),9項(xiàng)研究[7-11,13,15-16,19]病例與對(duì)照年齡相匹配,7項(xiàng)研究[7-8,10-13,15]性別相匹配,6項(xiàng)研究[7-8,10-11,13,15]年齡與性別同時(shí)匹配。

        關(guān)于暴露評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),所有研究均未采用血液樣本雙盲分析,僅有2項(xiàng)研究[11,20]未明確說明試劑來源,僅有4項(xiàng)研究[14,16,19,21]明確指出血清陽性Cut-off值,所有研究病例與對(duì)照檢測(cè)方法都相同。見表2。

        表1 納入研究的基本情況

        2.3 Meta分析結(jié)果

        2.3.1 抗EBV-VCA IgM抗體 納入分析的16個(gè)研究均對(duì)抗EBV-VCA IgM抗體進(jìn)行了檢測(cè),包括IM患者1 305例、對(duì)照者973例。IM患者血清抗EBV-VCA IgM抗體陽性率為86.86%(10.00%~97.22%),對(duì)照者為4.54%(0%~15.87%)。IM患者血清抗EBV-VCA IgM抗體總陽性率為82.30%(1 074/1 305),高于對(duì)照者[5.96%(58/973)]。各研究之間無異質(zhì)性,采用固定效應(yīng)模型計(jì)算結(jié)果,總體OR=81.67,95%CI為57.88~115.22,合并效應(yīng)量檢驗(yàn)結(jié)果Z=25.07,P<0.000 01,表明IM患者血清抗EBV-VCA IgM抗體陽性率明顯高于對(duì)照者(P<0.000 01)。見圖2。

        表2 納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

        圖2 我國(guó)IM患者和對(duì)照者血清抗EBV-VCA IgM抗體陽性率的Meta分析森林圖

        2.3.2 抗EBV-VCA IgG抗體 納入分析的16個(gè)研究中有11個(gè)研究對(duì)抗EBV-VCA IgG抗體進(jìn)行了檢測(cè),包括IM患者1 045例、對(duì)照者801例。病例組抗EBV-VCA IgG抗體血清陽性率為74.29%(3.85%~100.00%),對(duì)照組為20.00%(0.00%~83.33%)。IM患者血清抗EBV-VCA IgG抗體總陽性率為68.13%(712/1 045),高于對(duì)照者[23.22%(186/801)]。各研究之間異質(zhì)性較大,采用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算結(jié)果,總體OR=7.86,95%CI為2.05~30.25;合并效應(yīng)量檢驗(yàn)結(jié)果Z=3.00,P=0.003;表明IM患者血清抗EBV-VCA IgG抗體陽性率高于對(duì)照者(P=0.003)。見圖3。

        圖3 我國(guó)IM患者和對(duì)照者血清EBV-VCA IgG抗體陽性率Meta分析森林圖

        2.3.3 抗EBV-VCA IgA抗體 納入分析的16個(gè)研究中僅有4個(gè)研究對(duì)抗EBV-VCA IgA抗體進(jìn)行檢測(cè),包括IM患者306例、對(duì)照者294例。IM患者血清抗EBV-VCA IgA抗體總陽性率為28.43%(87/306),高于對(duì)照者[3.06%(9/294)]。各研究之間異質(zhì)性較大,采用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算結(jié)果,總體OR=15.45,95%CI為1.13~211.81;合并效應(yīng)量檢驗(yàn)結(jié)果Z=2.05,P=0.04;表明IM患者血清EBV-VCA IgA抗體陽性率高于對(duì)照者(P=0.04)。見圖4。

        圖4 我國(guó)IM患者和對(duì)照者血清EBV-VCA IgA抗體陽性率Meta分析森林圖

        2.3.4 抗EBV-NA IgG抗體 納入分析的16個(gè)研究中僅有4個(gè)研究對(duì)抗EBV-NA IgG抗體進(jìn)行了檢測(cè),包括IM患者278例、對(duì)照者148例。IM患者血清抗EBV-NA IgG抗體總陽性率為19.06%(53/278),低于對(duì)照者[25.68%(38/148)]。各研究之間異質(zhì)性較大,采用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算結(jié)果,總體OR=0.50,95%CI為0.08~3.00;合并效應(yīng)量檢驗(yàn)結(jié)果Z=0.76,P=0.45;表明IM患者與對(duì)照者抗EBV-NA IgG抗體血清陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

        2.3.5 抗EBEA IgM抗體 納入分析的16個(gè)研究中僅有3個(gè)研究對(duì)抗EBEA IgM抗體進(jìn)行了檢測(cè),包括IM患者208例、對(duì)照者123例。IM患者血清抗EBEA IgM抗體總陽性率為49.04%(102/208),高于對(duì)照者[9.76%(12/123)]。各研究之間無異質(zhì)性,采用固定效應(yīng)模型計(jì)算結(jié)果,總體OR=17.21,95%CI為7.76~38.15;合并效應(yīng)量檢驗(yàn)結(jié)果Z=7.00,P<0.000 01,表明IM患者血清抗EBEA IgM抗體陽性率高于對(duì)照者。見圖6。

        圖5 我國(guó)IM患者和對(duì)照者血清EBV-NA IgG抗體陽性率Meta分析森林圖

        圖6 我國(guó)IM患者和對(duì)照者血清抗EBEA IgM抗體陽性率Meta分析森林圖

        2.3.6 抗EBEA IgG抗體 納入分析的16個(gè)研究中僅有3個(gè)研究對(duì)抗EBEA IgG抗體進(jìn)行了檢測(cè),包括IM患者124例、對(duì)照者77例。IM患者血清抗EBEA IgG抗體總陽性率為12.10%(15/124),高于對(duì)照者[3.90%(3/77)]。各研究之間無異質(zhì)性,采用固定效應(yīng)模型計(jì)算結(jié)果,總體OR=4.21,95%CI為1.08~16.40,合并效應(yīng)量檢驗(yàn)結(jié)果Z=2.07,P=0.04;表明IM患者血清抗EBEA IgG抗體陽性率高于對(duì)照者(P=0.04)。見圖7。

        圖7 我國(guó)IM患者和對(duì)照者血清EBEA IgG抗體陽性率Meta分析森林圖

        2.4 亞組分析及敏感性分析

        對(duì)抗EBV-VCA IgG抗體、抗EBV-VCA IgA抗體和抗EBV-NA IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)的各個(gè)研究之間存在異質(zhì)性。由于僅有4個(gè)研究對(duì)抗EBVVCA IgA抗體和抗EBV-NA IgG抗體進(jìn)行檢測(cè),因此未進(jìn)行亞組分析。為了檢驗(yàn)不同因素對(duì)血清抗EBV-VCA IgG抗體陽性率總體OR值的影響,分別按研究質(zhì)量、對(duì)照類型選擇、抗EBV抗體檢測(cè)方法進(jìn)行亞組分析。

        按研究質(zhì)量進(jìn)行亞組分析。與研究質(zhì)量≥6分的高質(zhì)量組比較,研究質(zhì)量<6分的低質(zhì)量組總體OR值較高,為11.05;95%CI更寬,為0.50~244.10;其IM患者與對(duì)照者血清抗EBV-VCA IgG抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與未分組結(jié)果相反。高質(zhì)量組總體OR值為7.40,95%CI為1.46~37.41,其結(jié)果與未分組結(jié)果一致,表明IM患者與對(duì)照者血清EBV-VCA IgG抗體陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        按抗EBV抗體檢測(cè)方法進(jìn)行分組,分為ELISA組和非ELISA組。ELISA組的研究均為≥6分的高質(zhì)量研究,其結(jié)果與高質(zhì)量組結(jié)果相同。

        按對(duì)照類型選擇分為健康組和非I M 患者組。健康組總體OR值為11.15,95%CI為2.29~54.33,與未分組結(jié)果一致。非IM患者組總體OR值為2.98,95%CI為0.17~50.85,與未分組結(jié)果相反。

        各亞組間異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為0.05、0.63,P>0.05)。敏感性分析中,逐一剔除對(duì)抗EBV-VCA IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)的11個(gè)研究后,再分別進(jìn)行Meta分析,合并效應(yīng)量(OR值)進(jìn)行Z檢驗(yàn),所有P值均<0.05,結(jié)果無變化。說明本研究穩(wěn)定性較好,結(jié)果可靠。

        表3 IM患者與對(duì)照者不同亞組間血清EBV-VCA IgG抗體陽性率的Meta分析

        2.5 發(fā)表偏移評(píng)估

        采用Stata 12軟件中的Egger檢驗(yàn)評(píng)估納入的檢測(cè)抗EBV-VCA IgM抗體、抗EBV-VCA IgG抗體的文獻(xiàn)的發(fā)表偏移,結(jié)果顯示納入的研究不存在發(fā)表偏移(t值分別為0.68、0.21,P值分別為0.509、0.837)。見圖8、圖9。

        圖8 檢測(cè)抗EBV-VCA IgM抗體的文獻(xiàn)的發(fā)表偏移

        圖9 檢測(cè)抗EBV-VCA IgG抗體的文獻(xiàn)的發(fā)表偏移

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        EBV感染與多種疾病有關(guān),如多發(fā)性硬化[22]、惡性腫瘤、胃癌、霍奇金淋巴瘤及鼻咽癌[23-24]。有Meta分析證實(shí)EBV與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)有相關(guān)性[25]。不同年齡段人群感染會(huì)導(dǎo)致不同結(jié)果,青少年EBV原發(fā)感染會(huì)導(dǎo)致IM。EBV在上皮細(xì)胞或者口咽表面的B細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂解復(fù)制過程中產(chǎn)生抗EBV-VCA IgM抗體,該抗體是發(fā)生近期原發(fā)感染的標(biāo)志。機(jī)體處于恢復(fù)期時(shí)抗EBVVCA IgM抗體消失,但也可持續(xù)數(shù)月[26],一般來說不會(huì)持續(xù)終生。盡管抗EBV-VCA IgM抗體會(huì)在EBV感染的早期產(chǎn)生并可用于急性EBV感染診斷,但也有局限性,一些急性感染的兒童和成人不會(huì)產(chǎn)生抗EBV-VCA IgM抗體。而且,抗EBV-VCA IgM抗體也可與其他抗原相關(guān)病毒,如巨細(xì)胞病毒發(fā)生交叉反應(yīng)[27-28],因此會(huì)造成癥狀不典型IM患者的漏診。本研究結(jié)果顯示,IM患者血清抗EBV-VCA IgM抗體總陽性率為82.30%,高于對(duì)照者(5.96%);血清抗EBV-VCA IgG抗體總陽性率為68.13%,高于對(duì)照者(23.22%)。有研究結(jié)果顯示,抗EBV-VCA IgA抗體與鼻咽癌發(fā)病相關(guān),超過90%的鼻咽癌患者可檢出該抗體[29]。因此,抗EBV-VCA IgA抗體常用于鼻咽癌的篩查及病情評(píng)估[30]。本研究結(jié)果顯示,IM患者血清抗EBVVCA IgA抗體總陽性率為28.43%,高于對(duì)照者(3.06%)。血清抗EBV-VCA IgM/IgG/IgA抗體陽性率均與IM呈正相關(guān),但納入的檢測(cè)抗EBVVCA IgG抗體的各個(gè)研究之間異質(zhì)性較大。亞組分析結(jié)果顯示,各亞組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但研究方法的差異、病例與對(duì)照的選擇是否匹配是導(dǎo)致不同研究發(fā)生異質(zhì)性的原因。IM病程持續(xù)期間,抗EBEA IgG抗體僅能在3個(gè)月內(nèi)被檢測(cè)到,恢復(fù)期檢測(cè)到抗EBEA IgG抗體表明病毒處于再活化階段[31]。但僅靠抗EBEA IgG抗體并不能證明病毒再活化[32]。有研究結(jié)果表明20%的EBV感染患者血清抗EBEA IgG抗體能持續(xù)數(shù)年[1]。本研究納入的16個(gè)研究中僅有3個(gè)研究對(duì)抗EBEA IgM抗體、抗EBEA IgG抗體進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示IM患者血清EBEA IgM抗體、抗EBEA IgG抗體陽性率(49.04%和12.10%)均高于對(duì)照者(9.76%和3.90%)。Meta分析結(jié)果表明抗EBEA IgM/IgG抗體陽性率均與IM呈正相關(guān)。說明EBV復(fù)發(fā)感染也可導(dǎo)致IM。EBV-NA是EBV潛伏感染狀態(tài)下的表達(dá)產(chǎn)物,血清中抗EBV-NA IgG抗體出現(xiàn)遲緩,以較低滴度持續(xù)存在,該抗體的存在可排除急性感染。本研究結(jié)果顯示,IM患者和對(duì)照者血清抗EBV-NA IgG抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),血清抗EBV-NA IgG抗體陽性率與IM不存在相關(guān)性。Eggers檢驗(yàn)證實(shí)納入的文獻(xiàn)不存在發(fā)表偏移,但不同研究存在較高的異質(zhì)性,這主要是由于病例與對(duì)照之間缺乏一致性所致。個(gè)別研究對(duì)實(shí)驗(yàn)方法及病例來源未能詳細(xì)說明,這些問題在質(zhì)量評(píng)價(jià)中都可以看到。

        綜上所述,本Meta分析結(jié)果顯示,我國(guó)IM患者血清抗EBV-VCA抗體和抗EBEA抗體陽性率均明顯高于對(duì)照者,而血清抗EBEA抗體陽性率則低于對(duì)照者。由于本研究納入的部分文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果較低,因此結(jié)論還需要更多高質(zhì)量的研究來驗(yàn)證。

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