金方方， 金子錚， 劉 寧， 婁金麗

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京 100069）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌的90%以上，居我國(guó)惡性腫瘤病因的第4位，腫瘤致死病因的第3位，全球每年有50%以上的HCC新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在我國(guó)[1-2]。HCC起病隱匿、早期癥狀不典型，多中心發(fā)生，發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于中晚期且伴隨不同程度的肝硬化，手術(shù)切除率低，具有易早期播散、轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。目前，臨床常用的HCC治療方法有手術(shù)切除、肝動(dòng)脈導(dǎo)管化療栓塞、射頻消融、肝移植等。這些治療方法雖然能去除局部的病灶，但遠(yuǎn)期效果并不十分理想，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)75%[3]，術(shù)后5年生存率僅為30%～40%[4]。因此，尋找與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)的指標(biāo)有助于盡早發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的腫瘤，改善患者預(yù)后。在外周血單個(gè)核細(xì)胞中有一類(lèi)具有CD3高表達(dá)現(xiàn)象的T淋巴細(xì)胞（CD3brightT細(xì)胞），該群細(xì)胞分布廣泛，具有反應(yīng)迅速、升高明顯、增殖能力強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等免疫反應(yīng)特點(diǎn)，與感染及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。本研究擬探討CD3brightT細(xì)胞在HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)中的提示作用，為HCC臨床診療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年1月—2018年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院確診為HCC的患者69例，其中男53例、女6例，年齡49～72歲；69例患者中，有47例患者接受抗病毒治療，22例患者未接受抗病毒治療。TNM分期Ⅰ期19例、Ⅱ期32例、Ⅲ期8例。所有患者均有完整的病歷資料及長(zhǎng)期門(mén)診復(fù)診或住院治療記錄，具體時(shí)間間隔為：術(shù)后半年內(nèi)每月復(fù)查1次肝臟電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）或B超、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、肝功能，半年后每3個(gè)月復(fù)查1次，2年后每6個(gè)月復(fù)查1次，以術(shù)后5年或死亡為研究終點(diǎn)。復(fù)發(fā)以影像學(xué)診斷為準(zhǔn)，如B超、CT、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、肝動(dòng)脈造影等，單純AFP升高不作為復(fù)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。所有患者術(shù)前均有乙型肝炎病史，均無(wú)糖尿病、甲狀腺功能異常以及自身免疫性肝病等自身免疫性疾病史，且均未進(jìn)行過(guò)免疫治療。根據(jù)臨床資料統(tǒng)計(jì)患者5年內(nèi)的復(fù)發(fā)情況：5年內(nèi)復(fù)發(fā)52例，未復(fù)發(fā)17例。

1.2 病例入選、排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后病理或肝穿刺病理活檢確診為HCC的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝功能異常（術(shù)前Child-Pugh分級(jí)為C級(jí)）；術(shù)前有感染，如肺炎、腹膜炎、尿路感染等；術(shù)后病理或肝穿刺病理活檢未證實(shí)為HCC；失訪。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 根據(jù)HCC臨床分期及肝功能情況，經(jīng)臨床術(shù)前準(zhǔn)備、保肝治療后，行肝葉切除、肝葉不規(guī)則切除或介入（肝動(dòng)脈化療栓塞、射頻消融）治療。

1.3.2 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 分別采集所有患者術(shù)后1個(gè)月、復(fù)查及復(fù)發(fā)時(shí)的靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸抗凝，充分混勻，采用熒光抗體CD3-藻紅蛋白花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PeCy5）、CD8-藻紅蛋白-德克薩斯紅（phycoerythrin and Texas red tandem，ECD）、CD4-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）（美國(guó)BD公司）標(biāo)記淋巴細(xì)胞，用溶血?jiǎng)┤芙饧t細(xì)胞，離心，棄上清，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗2次，采用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）進(jìn)行檢測(cè)。采用Kaluza Analysis軟件（美國(guó)Beckman Coulter公司）分析CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞分別占總T細(xì)胞的百分比（CD3%、CD4%、CD8%），計(jì)算CD4/CD8比值。設(shè)門(mén)圈出CD3brightT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比（CD3bright%）。同時(shí)采用cobas e601全自動(dòng)免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）檢測(cè)血清AFP水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件及GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析（前向逐步法）評(píng)估各項(xiàng)目對(duì)HCC復(fù)發(fā)的提示作用。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD3bright T細(xì)胞表型特征分析

CD4+CD8雙參數(shù)設(shè)門(mén)顯示CD3brightT細(xì)胞不表達(dá)CD4分子，少部分表達(dá)CD8分子，主要為CD4-CD8-T細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 CD3bright T細(xì)胞表型特征分析

2.2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

復(fù)發(fā)組AFP、CD4%、CD8%高于未復(fù)發(fā)組（P＜0.01），CD3bright%低于未復(fù)發(fā)組（P＜0.01）。CD3%和CD4/CD8比值2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 HCC復(fù)發(fā)患者術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)的比較

與術(shù)后比較，復(fù)發(fā)時(shí)患者血清AFP水平明顯升高（P＜0.01）、CD3bright%降低（P=0.04），其他指標(biāo)2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 AFP、CD3%、CD4%、CD8%、CD4/CD8比值及CD3bright%與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

單變量Logistic回歸分析結(jié)果顯示，AFP、CD3%、CD8%及CD3bright%與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)[比值比（odds ratio，OR）分別為1.012、1.033、1.048和0.841，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為1.001～1.023、1.006～1.060、1.016～1.081、0.785～0.900。

多變量Logistic回歸分析結(jié)果顯示，AFP、CD3bright%與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)獨(dú)立相關(guān)（OR值分別為1.012和0.841，95%CI分別為1.001～1.023和0.783～0.902）。見(jiàn)表3。

表1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組各項(xiàng)指標(biāo)的比較 M（P25～P75）

表2 復(fù)發(fā)患者術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)的比較 M（P25～P75）

表3 AFP、CD3%、CD4%、CD8%、CD4/CD8比值及CD3bright%與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的單變量和多變量Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

HCC的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，針對(duì)HCC的免疫學(xué)研究一直是重點(diǎn)和熱點(diǎn)。以T細(xì)胞為主導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在HCC患者免疫監(jiān)視、殺傷和調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。T細(xì)胞主要分為CD4+T細(xì)胞亞群和CD8+T細(xì)胞亞群。CD4+輔助T細(xì)胞可直接或通過(guò)分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（interferon gamma，IFN-γ）、干擾素-α（interferon alpha，IFN-α）等起殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[6]。CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+細(xì)胞毒性T細(xì)胞分別通過(guò)人類(lèi)白細(xì)胞抗原Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視及殺傷作用?？鼓[瘤T細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙可減弱機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞數(shù)量增加可抑制機(jī)體免疫功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[7-8]，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。由此可見(jiàn)，T細(xì)胞亞群在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但與HCC復(fù)發(fā)的關(guān)系尚不明確。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組CD4%、CD8%高于未復(fù)發(fā)組（P＜0.01），CD4/CD8比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示CD4/CD8比值雖可在一定程度上反映HCC患者免疫系統(tǒng)的紊亂，但對(duì)于復(fù)發(fā)的提示作用有限。

根據(jù)T 細(xì)胞表面C D 3 分子的表達(dá)可區(qū)分C D 3brightT 細(xì)胞亞群。C D 3brightT細(xì)胞亞群在健康人群中普遍存在，有8 0%～8 4%的人均可檢測(cè)到該細(xì)胞群，占外周循環(huán)中T 細(xì)胞的3.1 5%±2.6 0%[5，9]。本研究結(jié)果顯示，HCC患者CD3brightT細(xì)胞主要為CD4-CD8-T細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5，9]。PAGET等[10]對(duì)純化的CD3brightT細(xì)胞進(jìn)行特征分析，CD3brightT細(xì)胞為γδT細(xì)胞，主要分布于皮膚及黏膜等屏障部位，在早期防御病原體中發(fā)揮重要作用。CD3brightT細(xì)胞還共表達(dá)趨化因子受體6（chemokine receptor 6，CCR6）和趨化因子受體2（chemokine receptor 2，CCR2）。當(dāng)發(fā)生炎癥時(shí)可通過(guò)下調(diào)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-23介導(dǎo)的穩(wěn)態(tài)受體CCR6，驅(qū)動(dòng)CD3brightT細(xì)胞快速聚集到遠(yuǎn)處的炎癥部位，參與屏障部位以外的免疫反應(yīng)[11]。CD3brightT細(xì)胞在腫瘤的進(jìn)展中也扮演著重要角色。作為固有免疫細(xì)胞，CD3brightT細(xì)胞可通過(guò)提供IFN-γ等炎性細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用[12-13]。目前，對(duì)IL-17介導(dǎo)的促腫瘤學(xué)說(shuō)尚存在爭(zhēng)議。有研究結(jié)果顯示，CD3brightT細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-17，促進(jìn)腫瘤部位血管的生成及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[14]。還有研究結(jié)果顯示，IL-17可通過(guò)促進(jìn)腫瘤部位中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)與活化而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[15]。BAO等[16]的研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者外周血中CD3brightT細(xì)胞水平低于健康人。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)的HCC患者外周血CD3brightT細(xì)胞水平顯著低于未復(fù)發(fā)患者，且在復(fù)發(fā)時(shí)進(jìn)一步降低。多變量Logistic回歸分析結(jié)果顯示，AFP、CD3bright%與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)獨(dú)立相關(guān)（OR值分別為1.012和0.841，95%CI分別為1.001～1.023和0.783～0.902）。較低的CD3brightT細(xì)胞水平與HCC較差的預(yù)后及高復(fù)發(fā)率相關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

總之，較低的CD3brightT細(xì)胞水平與HCC較差的預(yù)后及較高的復(fù)發(fā)率有關(guān)。對(duì)CD3brightT細(xì)胞在HCC患者免疫抑制狀態(tài)中的作用進(jìn)行研究有助于為HCC患者的免疫治療提供新的靶點(diǎn)。由于本研究為回顧性分析，且回顧時(shí)間為5年，可持續(xù)跟蹤的病例數(shù)有限，因此有關(guān)CD3brightT細(xì)胞在HCC中的作用還有待進(jìn)一步深入研究。