譚曾勇，冉 勤，胡瓊丹，趙詩蘭，馮漢清，楊 艷

(湖北民族大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施 445000)

黃酮類化合物廣泛存在于自然界，尤其在水果、蔬菜、茶、種子以及植物根部含量豐富。黃酮類化合物具有2-苯基色原酮結構[1-3]，雖不屬于維生素，但由于其在生物體內反應的重要作用和營養(yǎng)價值，被稱為“維生素P”[4-7]。大多數黃酮類化合物具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、解肝毒等功效[8-10]。蔓生草本植物絞股藍富含黃酮類化合物，屬藥食同源植物，在明朝就被載入《救荒本草》，含人參皂苷等數十種活性成分。國內外大量科研機構和臨床試驗證明[11-14]，絞股藍具有顯著降血脂、凈化血液、穩(wěn)定血壓、延年駐顏等功效；同時對提高睡眠質量、防治便秘、消暑解渴、增強免疫、保肝護肝等都有很好療效；還可緩解因吸煙、飲酒過度等帶來的不適[15-17]。文獻[18-19]報道，提取工藝對絞股藍總黃酮的提取量及抗氧化活性影響較大。因此，作者采用單因素實驗和正交實驗對絞股藍總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，并通過測定其對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率來評價其抗氧化活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

某品牌野生龍須絞股藍，購于恩施市中百倉儲。

蘆丁標準品(批號008029705)，上海甄準生物科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、維生素C，國藥集團化學試劑有限公司；硫酸亞鐵、雙氧水，天津光復科技發(fā)展有限公司；三羥甲基氨基甲烷，四川西亞化工有限公司；濃鹽酸，武漢洪山中南化工試劑有限公司；焦性沒食子酸，天津博迪化工有限公司；水楊酸，天津恒興化學試劑制造有限公司；二次蒸餾水。所用試劑均為分析純。

UV-2550型紫外分光光度儀，SHIMADZU；D1S型集熱式磁力攪拌器，上海予正儀器設備有限公司；FA1004B型電子天平，上海佑科儀表有限公司；800型離心機，上海云樓醫(yī)用儀器廠；KQ 2200B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；DW-2型調溫電熱器，江蘇通州光學儀器有限公司。

1.2 檢測波長的確定

以體積分數為60%的乙醇為溶劑，以氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁為顯色劑，分別繪制蘆丁標準溶液及絞股藍提取液的吸收曲線。結果顯示，絞股藍的最大吸收波長為510 nm，蘆丁的最大吸收波長為505 nm。由于蘆丁標準溶液在500～510 nm之間吸光度相差不大，因而后續(xù)標準曲線的制作及絞股藍提取液中總黃酮的測定均以505 nm為檢測波長。

1.3 標準曲線的繪制

參照文獻[7]配制0.200 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中；加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，靜置6 min；加入0.3 mL配制好的10%硝酸鋁溶液，靜置60 min；加入4 mL配制好的4%氫氧化鈉溶液，靜置15 min；用60%乙醇定容至刻度，靜置15 min；測定其在505 nm處吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.4 提取工藝的優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗

主要考察提取時間、提取溫度、乙醇體積分數、固液比、pH值、提取次數等對絞股藍總黃酮提取量的影響。通過預實驗，設計提取時間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，乙醇體積分數為20%、40%、60%、80%、100%，固液比為1∶10(g∶mL，下同)、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，pH值為3、5、7、8、10，提取次數為1、2、3、4。

1.4.2 正交實驗

為了更好地進行正交實驗方案的設計，分別對比了回流法及索氏提取法提取絞股藍總黃酮的效果。結果發(fā)現，索氏提取法提取的絞股藍總黃酮提取量更高，因此，正交實驗采用索氏提取法提取絞股藍總黃酮。

在單因素實驗的基礎上，以乙醇體積分數、固液比、pH值、虹吸次數為考察因素，以絞股藍總黃酮提取量為指標，采用L9(34) 正交實驗優(yōu)化絞股藍總黃酮提取工藝。

1.5 抗氧化活性的評價

1.5.1 對羥基自由基的清除效果

水楊酸能捕捉羥基自由基并產生有色物質，該物質在510 nm處有強吸收峰。若在反應體系中加入具有清除羥基自由基的物質時，會使有色物質生成量減少，溶液在510 nm處吸收峰強度會減弱或消失。

在10 mL容量瓶中依次加入9.0 mmol·L-1FeSO4溶液1.0 mL、9.0 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1.0 mL、8.8 mmol·L-1H2O2溶液1.0 mL；再分別量取1.0 mg·mL-1的絞股藍總黃酮提取液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL于容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，于37 ℃反應30 min；用紫外分光光度儀測定溶液在510 nm處吸光度A樣品；樣底管不加H2O2溶液，空白管不加絞股藍總黃酮提取液，同法測定溶液在510 nm處吸光度A樣底、A空白，按式(1)計算清除率。取相同濃度VC溶液重復上述實驗，以評價絞股藍總黃酮對羥基自由基的清除效果。

(1)

1.5.2 對超氧陰離子自由基的清除效果

鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應，生成超氧陰離子自由基以及有色中間產物，該產物在420 nm處有強吸收。若在反應體系中加入具有清除超氧陰離子自由基的物質時，超氧陰離子自由基的生成會受到抑制，溶液在420 nm處吸收峰強度減弱。

在10 mL容量瓶中加入pH值為8.2的0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，再分別加入1.0 mg·mL-1絞股藍總黃酮提取液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、2.0 mL，用蒸餾水稀釋到6.0 mL，搖勻，于25 ℃反應20 min；再加入0.4 mL 6.0 mmol·L-1鄰苯三酚(含10 mmol·L-1HCl)，搖勻，于25 ℃反應4 min；再滴2滴8.0 mol·L-1HCl終止反應；用蒸餾水稀釋至刻度，用紫外分光光度儀測定溶液在420 nm處吸光度A樣品；樣底管用10 mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚，空白管不加絞股藍總黃酮提取液，同法測定溶液在420 nm處吸光度A樣底、A空白，按式(1)計算清除率。取相同濃度VC溶液重復上述實驗，以評價絞股藍總黃酮對超氧陰離子自由基的清除效果。

2 結果與討論

2.1 標準曲線與回歸方程

以蘆丁濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線(圖1)。擬合得線性回歸方程A=13.05421c+0.00885，R2=0.99963。表明，蘆丁濃度在0.010～0.080 mg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 最優(yōu)提取工藝

2.2.1 單因素實驗結果

2.2.1.1 提取時間對絞股藍總黃酮提取量的影響(圖2)

由圖2可知，隨著提取時間的延長，絞股藍總黃酮提取量不斷升高，150 min后趨于穩(wěn)定。這可能是由于，提取一定時間后，原料中的黃酮類化合物基本被提取，繼續(xù)延長提取時間，提取量不再升高。因此，最優(yōu)提取時間為150 min。

2.2.1.2 提取溫度對絞股藍總黃酮提取量的影響(圖3)

圖2 提取時間對絞股藍總黃酮提取量的影響

圖3 提取溫度對絞股藍總黃酮提取量的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，絞股藍總黃酮提取量不斷升高，在90 ℃時達到最高。因此，最優(yōu)提取溫度為90 ℃。

2.2.1.3 乙醇體積分數對絞股藍總黃酮提取量的影響(圖4)

圖4 乙醇體積分數對絞股藍總黃酮提取量的影響

由圖4可知，隨著乙醇體積分數的增加，絞股藍總黃酮提取量先升高后降低，在乙醇體積分數為60%時達到最高。這可能是因為，乙醇體積分數過大，絞股藍不能充分溶解，不利于黃酮類物質的提取，導致提取量降低。因此，乙醇體積分數選擇60%較為適宜。

2.2.1.4 固液比對絞股藍總黃酮提取量的影響(圖5)

圖5 固液比對絞股藍總黃酮提取量的影響

由圖5可知，隨著固液比的減小，即溶劑用量的增加，絞股藍總黃酮提取量不斷升高，在料液比達到1∶50后趨于穩(wěn)定。這主要是由于，增加溶劑用量，有利于絞股藍中的黃酮類物質向提取液中擴散，從而提高總黃酮提取量；但當溶劑用量增加到一定值時，絞股藍表面與提取液之間的濃度差不再是影響提取量的主要因素，此時溶劑溶解的蛋白質、碳水化合物等物質也會增多。因此，固液比選擇1∶50較為適宜。

2.2.1.5 pH值對絞股藍總黃酮提取量的影響(圖6)

圖6 pH值對絞股藍總黃酮提取量的影響

由圖6可見，隨著pH值的增大，絞股藍總黃酮提取量先升高后降低，在pH值約為8時達到最高；過酸條件下，提取量較低；過堿條件下，提取量下降明顯。這可能是由于，過酸和過堿環(huán)境都有可能破壞黃酮類物質的成分，導致總黃酮提取量降低。因此，pH值選擇8較為適宜。

2.2.1.6 提取次數對絞股藍總黃酮提取量的影響(圖7)

由圖7可知，提取2次時的絞股藍總黃酮提取量較提取1次時的提取量呈直線升高；提取3次時，提取量平緩上升；提取4次時，提取量則有下降的趨勢。這可能是因為，隨著提取次數的增加，提取時間相應延長，造成總黃酮出現分級現象，從而影響總黃酮提取量。因此，最優(yōu)提取次數為2次。

圖7 提取次數對絞股藍總黃酮提取量的影響

2.2.2 正交實驗結果

L9(34)正交實驗的因素與水平見表1，結果與分析見表2，方差分析見表3。

表1 正交實驗的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

水平因素A.乙醇體積分數/%B.固液比/(g∶mL)C.pH值D.虹吸次數/次1 40 1∶30 4 12 2 60 1∶50 8 18 3 80 1∶70 10 24

表2 正交實驗結果與分析

Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiments

實驗號ABCD提取量mg·g-11111156.4742122276.1133133379.0234212368.2065223165.5506231261.1427313257.9998321358.3139332169.542k170.53760.89358.64363.855 k264.96666.65971.28765.085 k361.95169.90267.52468.514 R8.5869.00912.6444.659

表3 方差分析

Tab.3 Variance analysis

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性乙醇體積分數113.82820.7916.940無固液比124.93220.8686.940無pH值252.90321.7576.940無虹吸次數34.97520.2436.940無誤差287.884

由表2、3可知，各因素對絞股藍總黃酮提取量的影響大小依次為：pH值>固液比>乙醇體積分數>虹吸次數，最優(yōu)工藝組合為A1B3C2D3，即乙醇體積分數40%、固液比1∶70、pH值8、虹吸次數24。

在最優(yōu)提取條件下，采用索氏提取法提取絞股藍總黃酮， 2次重復實驗的總黃酮提取量分別為83.296 mg·g-1、83.294 mg·g-1，平均值為83.295 mg·g-1。表明，該方法具有非常好的重復性，優(yōu)化的提取工藝是可行的。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 對羥基自由基的清除率(圖8)

圖8 對羥基自由基的清除率

由圖8可知，隨著VC濃度的增加，其對羥基自由基的清除率迅速升高，當VC濃度高于0.06 mg·mL-1時，清除率超過95.000%，增幅趨緩；隨著絞股藍總黃酮提取液濃度的增加，其對羥基自由基的清除率逐漸升高，當絞股藍總黃酮提取液濃度達到0.18 mg·mL-1時，清除率達到56.757%。表明，絞股藍總黃酮提取液與VC對羥基自由基均具有一定的清除能力，VC對羥基自由基的清除效果更明顯。這是因為，VC為人工合成品，純度高，其抗氧化活性相應較高；而絞股藍未經處理，提取得到的總黃酮為天然抗氧化劑，安全性高，且有些結構的黃酮類化合物抗氧化能力較差，因此，絞股藍總黃酮的抗氧化活性較VC差。

2.3.2 對超氧陰離子自由基的清除率(圖9)

圖9 對超氧陰離子自由基的清除率

由圖9可知，隨著VC濃度的增加，其對超氧陰離子自由基的清除率迅速升高，當VC濃度高于0.08 mg·mL-1時，清除率超過98.230%，增幅趨緩；隨著絞股藍總黃酮提取液濃度的增加，其對超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高，當絞股藍總黃酮提取液濃度達到0.20 mg·mL-1時，清除率達到65.151%。表明，絞股藍總黃酮提取液和VC對超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，VC對超氧陰離子自由基的清除效果更明顯。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗對絞股藍總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，并通過測定其對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率來評價其抗氧化活性。結果表明：各因素對絞股藍總黃酮提取量的影響大小依次為：pH值>固液比>乙醇體積分數>虹吸次數；最佳提取工藝為：提取時間150 min、提取溫度90 ℃、乙醇體積分數40%、固液比1∶70(g∶mL)、pH值8、虹吸次數24，在此條件下，絞股藍總黃酮提取量達到83.295 mg·g-1；絞股藍總黃酮提取液和VC對羥基自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，但在相同濃度下，VC的抗氧化活性更高；當絞股藍總黃酮濃度為0.18 mg·mL-1時，其對羥基自由基的清除率達到56.757%；當絞股藍總黃酮濃度為0.20 mg·mL-1時，其對超氧陰離子自由基的清除率達到65.151%。