亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        AKR1B10基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

        2020-04-21 13:08:54錢瑞坤馬長(zhǎng)林
        臨床肝膽病雜志 2020年4期
        關(guān)鍵詞:克隆肝癌培養(yǎng)基

        錢瑞坤, 馬長(zhǎng)林, 喬 森

        濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院 肝膽外科, 山東 濟(jì)寧 272100

        肝細(xì)胞癌(HCC)是肝臟中最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性腫瘤,也是全球癌癥死亡的第二大主要原因。已發(fā)現(xiàn)醛酮還原酶家族1成員B10(aldo-keto reductase family 1 member B10,AKR1B10)在HCC、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌中高表達(dá)[1-4]。

        AKR1B10是醛酮還原酶(aldo-keto reductase,AKR)超家族的一員,AKR是一種以NADPH為輔酶的氧化還原酶基因超家族,可催化醛酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇。AKR在不同的生物體內(nèi)可參與多種生物學(xué)過(guò)程,包括羰基解毒、滲透調(diào)節(jié)、激素代謝、脂質(zhì)合成、腫瘤的發(fā)生與治療[5]。AKR1B10在人類肝癌中高表達(dá),但其調(diào)控機(jī)制仍不明確。為了解AKR1B10在肝癌中的致癌作用,本研究使用shRNA敲減方法進(jìn)一步分析了AKR1B10沉默對(duì)肝癌生物表型的影響。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2及Huh7 HCC細(xì)胞株均在含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 g/ml)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),放置于37℃、含有5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

        1.2 AKR1B10敲減 將1×105Huh7及HepG2 HCC細(xì)胞接種在裝有2 ml新鮮完全培養(yǎng)基的6孔板中。過(guò)夜孵育后,除去培養(yǎng)基,加入2 ml含shRNA-AKR1B10慢病毒顆粒的培養(yǎng)基(含10 μg/ml polybrene)。24 h后,除去含有病毒的培養(yǎng)基,每孔加入2 ml新鮮完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)。48 h后,用含有1 μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性細(xì)胞。

        1.3 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 穩(wěn)轉(zhuǎn)shRNA-scramble的HepG2及 Huh7細(xì)胞(對(duì)照組)及敲減AKR1B10的HepG2及 Huh7細(xì)胞(敲減組)消化后,收集5×105個(gè)細(xì)胞,AnnexinV-APC和PI(Abnova)染料雙染,利用流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)進(jìn)行檢測(cè),具體的實(shí)驗(yàn)步驟參考試劑盒說(shuō)明書。

        1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用胰酶消化后計(jì)數(shù)。在6孔板里進(jìn)行,每孔鋪種Huh7細(xì)胞2000個(gè),每孔2 ml培養(yǎng)液 (DMEM+10% FBS) 于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每3天更換1次培養(yǎng)液,培養(yǎng)10 d左右,棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS洗滌2次之后,甲醇固定15 min,再用結(jié)晶紫染色10 min。在鏡下計(jì)數(shù),≥50個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)即為一個(gè)克隆。

        1.5 檢測(cè)活性氧(ROS) 使用過(guò)氧化物敏感性熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。 將細(xì)胞鋪在6孔板中,然后使用無(wú)血清的DMEM將DCFH-DA的終濃度調(diào)整為20 μmol/L,每孔加入1 ml DCFH-DA稀釋液,37 ℃孵育30 min,并用PBS洗滌3次。ROS水平通過(guò)流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)測(cè)定。

        1.6 患者肝癌組織及異體移植瘤模型 肝癌組織來(lái)自本院肝膽外科2018年1月-2018年6月收治的6例肝癌患者。本研究通過(guò)濟(jì)寧第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批[批號(hào):2018倫審研第(017)號(hào)]及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批[批號(hào):2018倫審研第(045)號(hào)],所有患者均簽署知情同意書。實(shí)驗(yàn)中使用了4~6周齡的BALB-c/Nude小鼠,購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司。將AKR1B10敲減組以及對(duì)照組的Huh7細(xì)胞皮下注射到BALB-c/Nude雌性小鼠的左下肢(每只小鼠100 μl細(xì)胞懸液,包含4×106個(gè)細(xì)胞)。注射后第7天開(kāi)始,每3天記錄1次腫瘤體積。

        2 結(jié)果

        2.1 AKR1B10在HCC細(xì)胞和HCC組織中的表達(dá) CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)提示AKR1B10 mRNA在HCC細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞(https://portals.broadinstitute.org/ccle)(圖1a)。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)顯示,與癌旁組織(n=220)相比,HCC組織(n=225)中AKR1B10 mRNA的表達(dá)增加了10倍以上(圖1b)。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析了HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),提示AKR1B10 mRNA在HCC組織中高表達(dá)(圖1c)。同時(shí),本研究在6例HCC患者中檢測(cè)到AKR1B10在HCC組織中的表達(dá)高于癌旁組織(圖1d)。

        2.2 AKR1B10沉默對(duì)HCC細(xì)胞克隆、凋亡的影響 與對(duì)照組細(xì)胞相比,AKR1B10敲減的Huh7和HepG2細(xì)胞(使用不同的慢病毒敲減Huh7和HepG2細(xì)胞中的AKR1B10基因,分別標(biāo)記為1#和2#)中AKR1B10的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P值均<0.01)(圖 2a)。與對(duì)照組相比,敲減組中觀察到細(xì)胞集落形成的能力顯著下降(P值均<0.001)(圖2b,表1)。在AKR1B10敲減的情況下,肝癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P值均<0.001)(圖2c,表1)。Western Blot表明,AKR1B10敲減后導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白(包括剪切后的Caspase-3和RARP)的表達(dá)增加(圖3a)。

        表1 敲減AKR1B10后HCC細(xì)胞克隆和凋亡的情況

        注:與對(duì)照組比較,1)P<0.001。

        2.3 AKR1B10敲減通過(guò)ROS超載引起廣泛的DNA損傷 如圖3b所示,AKR1B10敲減組細(xì)胞的ROS水平高于對(duì)照組。為了研究敲減AKR1B10的HCC細(xì)胞中升高的ROS水平是否引起DNA損傷,通過(guò)Western Blot檢測(cè)γ-H2AX和p-ATMser1981的水平以確定DNA損傷的存在。結(jié)果顯示,AKR1B10敲減可以導(dǎo)致p-ATMser1981和γ-H2AX的累積(圖3a)。

        注:a,CCLE 數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC細(xì)胞系中AKR1B10 mRNA水平; b,Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中癌旁組織與HCC組織的AKR1B10 mRNA水平; c,UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC組織與癌旁組織的AKR1B10mRNA表達(dá)水平; d,Western Blot評(píng)估AKR1B10在本研究6例HCC患者癌旁組織(P)和癌組織(T)中的表達(dá)。

        圖1AKR1B10在HCC中的表達(dá)情況

        2.4 AKR1B10敲減可延遲腫瘤發(fā)生,降低HCC異種移植小鼠的腫瘤體積 將AKR1B10敲減組以及對(duì)照組的Huh7細(xì)胞皮下注射到BALB-c/Nude雌性小鼠的左下肢,28 d后拍照并剝離瘤體,如圖 4a~b 所示,AKR1B10敲減的HCC細(xì)胞致癌能力減弱,腫瘤體積減少。從異體移植后第13天開(kāi)始,與對(duì)照組相比,AKR1B10敲減組腫瘤體積明顯縮小(P值均<0.05)(圖4c)。對(duì)照組瘤體石蠟包埋后,HE染色如圖4d所示。

        注:a,Western Blot 檢測(cè) AKR1B10敲減組細(xì)胞中AKR1B10蛋白水平; b,敲減組Huh7細(xì)胞集落形成的結(jié)果; c,流式細(xì)胞分析法檢測(cè)敲減組HepG2 以及Huh7 細(xì)胞的凋亡。

        圖2敲減AKR1B10對(duì)HCC細(xì)胞克隆、凋亡的影響

        3 討論

        肝癌是全球第五大最常見(jiàn)的癌癥,已證實(shí)對(duì)公共健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。盡管當(dāng)前的治療策略在過(guò)去幾十年中已有所改善,但長(zhǎng)期生存率仍不令人滿意[7]。AKR1B10在HCC中過(guò)表達(dá),在相鄰的肝組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)。 HCC細(xì)胞中AKR1B10表達(dá)的沉默導(dǎo)致:(1)HCC細(xì)胞集落形成減少、細(xì)胞凋亡增加;(2)HCC細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和DNA損傷增強(qiáng);(3)延遲腫瘤發(fā)生和體內(nèi)腫瘤負(fù)荷減少。這些結(jié)果均說(shuō)明AKR1B10參與HCC的發(fā)生和發(fā)展。

        為了闡明AKR1B10在HCC中的調(diào)控機(jī)制,筆者在GCBI網(wǎng)站(www.gcbi.com.cn)上預(yù)測(cè)AKR1B10參與多種代謝途徑,包括戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉(zhuǎn)化、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、甘油脂代謝、丙酮酸代謝。

        注: a,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)AKR1B10敲減引起的細(xì)胞內(nèi)ROS變化(空白組為Huh7細(xì)胞不與DCFH-DA共孵育,H2O2為陽(yáng)性對(duì)照組); b,Western Blot檢測(cè)AKR1B10敲減的HCC細(xì)胞中DNA損傷和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

        圖3AKR1B10沉默后誘導(dǎo)ROS超載

        AKR1B10可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)代謝在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。前期研究[8-10]已經(jīng)報(bào)道了由于代謝過(guò)程中ATP耗竭引起ROS升高會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡增加。筆者推測(cè),由AKR1B10敲減引起的ROS超負(fù)荷可能導(dǎo)致HCC細(xì)胞內(nèi)的DNA發(fā)生氧化損傷。本研究中,通過(guò)DCFH-DA探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AKR1B10敲減可誘導(dǎo)細(xì)胞ROS積累,從而導(dǎo)致DNA損傷。ATM是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)[11]。在暴露的DNA雙鏈斷裂應(yīng)力下,ATM在ser1981位點(diǎn)被自身磷酸化激活。γ-H2AX是一種變異的組蛋白,可響應(yīng)DNA雙鏈斷裂而在ser139處被磷酸化激活,從而在斷裂點(diǎn)處形成病灶[12]。HCC細(xì)胞系中p-ATMser1981和γ-H2AX的增加更加確定了筆者的推論。據(jù)報(bào)道,與正常細(xì)胞相比,癌細(xì)胞的ROS水平較高[13]。穩(wěn)定的ROS水平還可以充當(dāng)化學(xué)信使,激活NF-κB和p38 MAPK等信號(hào)通路,從而影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡[14]。AKR1B10的高表達(dá)可以在HCC中維持相對(duì)穩(wěn)定的ROS水平。推測(cè)敲減AKR1B10引起異常代謝,然后增加氧化應(yīng)激和廣泛的DNA損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        綜上,本研究證明AKR1B10減少了氧化應(yīng)激超負(fù)荷和DNA損傷,從而促進(jìn)了HCC的發(fā)生和發(fā)展。AKR1B10是預(yù)后不良的有前途且具有高度潛力的生物標(biāo)志物?;谶@些發(fā)現(xiàn),AKR1B10是否為HCC的潛在新治療靶標(biāo)有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

        注:a~b,異體移植shRNA-AKR1B10和對(duì)照組小鼠的腫瘤體積情況; c,腫瘤生長(zhǎng)曲線(與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001);d,Huh7皮下成瘤后的HE染色結(jié)果(×200)。

        圖4敲減AKR1B10后異體移植HCC細(xì)胞成瘤體積的變化

        猜你喜歡
        克隆肝癌培養(yǎng)基
        克隆狼
        浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
        LCMT1在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后的意義
        蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
        各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個(gè)事項(xiàng)
        抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
        KBM581培養(yǎng)基:人T細(xì)胞誘導(dǎo)與擴(kuò)增培養(yǎng)基應(yīng)用指南
        microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用
        Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
        microRNA在肝癌診斷、治療和預(yù)后中的作用研究進(jìn)展
        久久久久亚洲av无码a片软件 | 国产高清一级毛片在线看| 亚洲中文字幕不卡无码| 今井夏帆在线中文字幕| 日本女优在线一区二区三区 | 亚洲国产成人AV人片久久网站| 亚洲国产精品美女久久久| 日本成人精品一区二区三区| 欧洲美熟女乱av亚洲一区| 偷偷色噜狠狠狠狠的777米奇| 精品无码一区二区三区亚洲桃色| 五月婷网站| 中文字幕av久久激情亚洲精品 | АⅤ天堂中文在线网| 免费人成网站在线播放 | 久久人人玩人妻潮喷内射人人| 亚洲无码夜夜操| 男女搞黄在线观看视频| 中文字幕人妻互换av| 国产免费a∨片在线软件| 国产av影片麻豆精品传媒| аⅴ天堂一区视频在线观看| 成人一区二区三区蜜桃| 在线国产激情视频观看| 免费无码精品黄av电影| 97se亚洲国产综合自在线| 欧美日韩激情在线一区二区| 国产av在线观看91| 狠狠色欧美亚洲狠狠色www| 欧美最猛黑人xxxx黑人表情| 99久久久精品免费| 日本一区二区不卡二区| 老师开裆丝袜喷水视频| 久久综合国产乱子伦精品免费| 91av手机在线观看| 一区二区三区在线视频免费观看| 亚洲高清国产成人精品久久| 成人内射国产免费观看| 精品亚洲aⅴ在线观看 | 自拍偷拍一区二区三区四区| 国产av在线观看久久|