薛 磊，趙漢文，李小斌，郭 斌，王 穎，郭志剛，潘廣樂，李 軒

(陜西中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，陜西 寶雞 721013)

煙草是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年來，隨著我國簽署《世界衛(wèi)生組織煙草控制框架公約》，吸煙與健康問題日益受人們重視。

焦油是煙草燃燒時煙氣中主要的有害物質，其所包含的多種成分直接影響著煙草的危害性[1]。目前國內(nèi)常用的煙草物理減害降焦技術多為通過提高濾嘴過濾和吸附性能，或采用激光打孔接裝紙、高透氣度成型紙和卷煙盤紙，以增加抽吸時的空氣進入量來稀釋主流煙氣，來降低煙氣中焦油和有害成分含量[2]。然而，現(xiàn)有物理減害降焦技術在降低卷煙焦油時，會造成煙氣的香氣明顯損失，煙氣有發(fā)干等不良感官現(xiàn)象，影響煙草吸食的品質[3]。

研究表明，煙葉中淀粉[4,5]、蛋白質[6]、纖維素和果膠[7]等含量不僅影響煙葉的感官質量，同時這些大分子有機物在不完全燃燒時可顯著影響煙氣的總粒相物、焦油[8,9]，和氫氰酸(HCN)、亞硝胺類(NNK)、苯并[a]芘(B[a]P)和巴豆醛等重點有害物質[10]的釋放量。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)微生物在煙葉大分子有機物的分解與轉化過程中發(fā)揮著重要作用[11～13]，即可通過微生物發(fā)酵來降低煙葉中淀粉[4]、蛋白質[6]、纖維素[14]和果膠[15]等物質含量以提升煙葉品質。但這些研究僅針對產(chǎn)單一酶活的微生物來研究其對煙葉品質的影響，對于同時產(chǎn)多種酶活性的煙草微生物及其對煙葉品質改善和降低有害成分釋放作用的研究報道較少。

因此，筆者研究通過對煙草微生物資源進行分離收集，并對其產(chǎn)多種酶能力和煙絲發(fā)酵效果進行篩選，研究煙草微生物對煙葉品質和有害成分釋放量的影響，探討將其應用于煙草發(fā)酵的可能，為煙草增香減害微生物資源的發(fā)掘及其應用提供技術指導與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙葉 微生物分離煙葉樣品來源：云南省昆明、曲靖、保山等產(chǎn)地的醇化煙葉。

供試煙絲：配方葉組煙絲，煙絲水分含量為12%。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基[16]：細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基。菌種液體培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基。

產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基：淀粉酶篩選培養(yǎng)基[4]，蛋白酶篩選培養(yǎng)基[6]，纖維素酶篩選培養(yǎng)基[14]，果膠酶篩選培養(yǎng)基[15]。

1.2 方法

1.2.1 煙葉表面微生物分離 稱取煙葉樣品10.0 g，采用逐級稀釋法[16]，挑取單菌落，純化后備用。

1.2.2 菌株酶活性篩選 將分離到的菌株鑒定去重后，點接于產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，以確定菌株產(chǎn)淀粉酶[4]、蛋白酶[6]、纖維素酶[14]或果膠酶[15]的功能，并測量菌株周圍透明水解圈和菌落直徑(淀粉酶平板需碘液染色，纖維素酶和果膠酶平板需剛果紅溶液染色)，計算酶活比值：

酶活比值=(水解圈直徑-菌落直徑)/菌落直徑

1.2.3 煙絲發(fā)酵試驗與感官評吸 選取產(chǎn)酶和降解篩選試驗表現(xiàn)較好的菌株，將單菌株接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃、180 r·min-1下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h。菌液于4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，將收集的單菌株菌體用無菌水配制成菌懸液，均勻噴灑在供試煙絲表面，以等量無菌水處理做對照，置于32 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵培養(yǎng)46 h后，將煙絲烘干至水分為12%，備用。

將發(fā)酵后的煙絲樣品在25 ℃、相對濕度65%條件下平衡24 h，卷制成卷煙。由具有卷煙感官評吸技術資格的7人組成感官評吸評委組，參照國家及行業(yè)標準GB/T 5606.4-2005、YC/T 415-2011采用整體循環(huán)法進行感官質量綜合評價。

1.2.4 理化指標和致香成分測定 理化指標檢測：參照行業(yè)標準YC/T 159-2002、YC/T 160-2002、YC/T 162-2002、YC/T 173-2003 及YC/T 161-2002對煙絲中總糖和還原糖、煙堿、氯、鉀和總氮進行檢測，并檢測煙絲淀粉[5]、蛋白質[6]和氨基酸[17]、纖維素和果膠[7]含量變化。

致香成分測定：挑選煙支重量、吸阻符合要求的煙支，在標準抽吸條件下通過吸煙機抽吸，對樣品主流煙氣中的粒相物用濾片進行捕集，將濾片捕集物萃取濃縮至一定體積后進行GC/MS分析。GC/MS色譜條件：色譜柱：DB-35MS彈性石英毛細管柱(60 m × 0.32 mm × 0.25 μm)；進樣量：1 μL；進樣口溫度：240℃；載氣：He；流速：1 mL·min-1；接口溫度：250 ℃；升溫梯度：從初始溫度50 ℃保持2 min，以3 ℃·min-1升溫至160 ℃，保留1 min，再以4 ℃·min-1升溫至280 ℃，保留時間20 min；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：35～455 amu；圖譜庫：NBS，WILEY標準譜庫。

1.2.5 主流煙氣指標和有害成分釋放量測定及危害性指數(shù)計算 參照國家標準GB/T 5606.5-2005測定主流煙氣中總粒相物、焦油、煙堿、CO等煙氣指標，參照國家及行業(yè)標準GB/T 23356-2009、YC/T 253-2008、GB/T 23228-2008、YC/T 377-2010、GB/T 21130-2007、YC/T 255-2008、YC/T 254-2008測定主流煙氣中CO，HCN，NNK，NH3，B[a]P，苯酚和巴豆醛的釋放量，并參照文獻[18]計算煙氣危害性指數(shù)H，計算公式如下：

H=(∑Ci/Ri)×(10/7)

式中，H表示煙氣危害性指數(shù)；C表示各項有害成分煙氣實測值，R表示各項有害成分參考值。CO，HCN，NNK，NH3，B[a]P，苯酚和巴豆醛釋放量參考值分別取每支14.20 mg、146.30 μg、5.50 ng、8.10 μg、10.90 ng、17.40 μg和18.60 μg-1[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 煙葉中微生物分離與鑒定

從供試煙葉樣品中共分離得到可培養(yǎng)細菌菌株159株。提取細菌菌株DNA，擴增16S rRNA基因序列在EzBioCloud庫中進行同源性比對，核苷酸序列比對結果表明，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)為供試煙葉樣品中可培養(yǎng)細菌中的優(yōu)勢種群。

2.2 微生物產(chǎn)酶功能篩選

產(chǎn)酶和降解特性篩選試驗表明(圖1)，多數(shù)細菌具有產(chǎn)胞外酶的能力，但產(chǎn)酶能力不同。如表1所示，其中，菌株YBM-1、YBM-6、YBG-5、YDP-21和YDP-23同時具備產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶4種胞外酶的能力，其余菌株具備可產(chǎn)2或3種酶的能力，菌株YBM-2僅具備產(chǎn)果膠酶能力。其中，菌株YBM-6產(chǎn)蛋白酶能力相對較強，其酶活比值為6.00；菌株YBG-5產(chǎn)淀粉酶能力較強，其酶活比值為1.18；產(chǎn)纖維素酶能力較高的菌株為YDP-23，其酶活比值達17.50；菌株YDP-21產(chǎn)果膠酶的酶活比值為16.50。

2.3 微生物發(fā)酵后煙葉感官質量變化

由表2可知，不同的菌株對煙葉感官質量各指標影響存在一定差異。與對照相比，各單菌株對供試煙絲的感官質量有不同程度的改善作用。并且，同時具備產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶4種酶能力的菌株對供試煙絲感官質量提升作用效果更好。其中，菌株YBG-5較對照樣可明顯改善煙氣狀態(tài)增加煙氣細膩感；菌株YDP-23可明顯提升煙氣香氣質，增加煙氣甜感，提升余味的津潤感，降低雜氣；菌株YBM-6可明顯增加香氣量，降低煙氣的刺激性，改善余味的舒適性。其余菌株發(fā)酵處理對供試煙絲感官質量改善效果次之。

選取對供試煙絲感官質量各項改善效果較好的菌株YBG-5、YDP-23和YBM-6進行配方組合試驗，最終形成的復合微生物配方T1(YBM-6∶YBG-5∶YDP-23=3∶1∶0.5)和T2(YBM-6∶YBG-5∶YDP-23=2∶0.5∶1)對供試煙絲的感官質量有進一步改善。如表3所示，經(jīng)復合微生物配方T1、T2發(fā)酵處理樣的感官質量得分分別為89.28和88.83，較未經(jīng)微生物發(fā)酵的對照樣分別提升1.13分和0.68。復合微生物配方T1發(fā)酵處理樣明顯改善煙氣的細膩度，香氣質和香氣量均有增加，雜氣減輕，刺激性減弱。

2.4 復合微生物發(fā)酵后煙葉化學成分和香味成分變化

如表4所示，與對照相比，經(jīng)復合微生物配方T1、T2發(fā)酵處理后，煙絲化學成分中淀粉、蛋白質、纖維素、果膠、總糖、還原糖、總氮和氨基酸含量均有明顯變化，煙堿、氯和鉀含量變化不大。其中，經(jīng)復合微生物配方T2處理的供試煙絲中淀粉、蛋白質和果膠含量較對照明顯降低，總糖、還原糖和總氮含量較對照有明顯增高。此外，復合微生物配方T1處理的供試煙絲的糖堿比為11.10，較對照提升明顯，T2處理次之。

表1 部分菌株產(chǎn)4種胞外酶活性比值

表2 部分菌株發(fā)酵處理對供試煙絲感官質量的影響

注：單項分值為10分，打分單位為0.5分，各項取平均值。

表3 復合微生物配方發(fā)酵處理對供試煙絲感官質量的影響

注：參照國標GB5606.4-2005《卷煙 第4部分 感官技術要求》評價計分，各項取平均值。

表4 復合微生物配方發(fā)酵處理對供試煙絲化學成分的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

表5 復合微生物配方發(fā)酵處理對供試煙絲香味成分的影響 (μg·支-1)

GC/MS分析結果表明，經(jīng)復合微生物配方T1、T2發(fā)酵處理樣和對照樣的煙氣中共同檢測出的香味化合物為52種，T1和T2處理樣煙氣中香味成分總含量較對照分別提升38.05%和16.84%。如圖2所示，復合微生物配方T1處理樣煙氣中在酮類、醇類、稠環(huán)芳烴類、萜烯類香味成分含量較對照有明顯增加，分別較對照增加了59.52%、47.74%、36.21%和33.70%。其中，具香味化合物如大馬酮、二氫-β-紫羅蘭酮、茄酮、巨豆三烯酮、糠醇、糠醛、3-氧代-α-紫羅蘭醇、植醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛、D-檸檬烯、香茅醛、新植二烯、吲哚、麥芽酚等的含量較對照樣有著不同程度的提高(表5)。并且，在復合微生物配方T1處理樣煙氣中，常見煙草香味成分如麥芽酚含量較對照提升了165.23%，大馬酮含量提升了80.53%，3-氧代-α-紫羅蘭醇含量提升了74.63%，巨豆三烯酮含量提升了69.03%。

2.5 復合微生物發(fā)酵后煙葉有害成分變化

由表6可知，經(jīng)上述復合微生物配方T1和T2發(fā)酵處理后的供試煙絲的焦油量每支分別為6.05 mg和6.20 mg，較對照樣分別下降9.43%和7.19%，CO含量分別下降0.50 mg和0.45 mg。同時，復合微生物配方T1和T2發(fā)酵處理降低了吸入煙氣的單口焦油量，較對照分別下降14.99%和14.02%。

表6 復合配方微生物發(fā)酵處理對供試煙絲常規(guī)有害成分的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

表7 復合配方微生物發(fā)酵處理對供試煙絲主流煙氣中7項有害成分及危害性的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

表7為供試煙絲主流煙氣中7種有害成分的釋放量，與對照樣相比，經(jīng)復合微生物配方T1和T2發(fā)酵處理后主流煙氣中有害成分的釋放量均有不同程度的下降。其中復合微生物配方T1處理樣的主流煙氣中的HCN、巴豆醛、NH3、苯酚和B[a]P含量較對照樣分別下降16.50%、13.74%、9.83%、9.24%和7.05%。經(jīng)復合微生物配方T1發(fā)酵處理后煙氣危害性指數(shù)為5.64，較對照下降0.51，T2發(fā)酵樣煙氣危害性指數(shù)為5.69，較對照下降0.46。

3 討論

目前，利用微生物發(fā)酵技術處理煙葉，以提高煙葉品質是煙草行業(yè)的重點研究方向[12]。研究表明，微生物可通過生物酶的催化直接或間接參與煙葉中原物質的分解和新物質的生成，進而影響煙葉品質[13]。與國內(nèi)外現(xiàn)有利用具產(chǎn)單一酶特性的微生物[4,6,14,15]進行發(fā)酵改善煙葉品質的研究不同，本研究從具產(chǎn)多種酶特性的微生物及其作用于煙葉化學成分角度開展，篩選到可同時產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的多酶活功能型菌株，組合而成的復合微生物配方不僅對煙葉品質具有明顯的提升效果，并可有效降低煙氣危害性，這一結果為煙草增香減害研究提供了新的研究思路。

復合配方微生物可能的作用機理在于，其所包含的同時產(chǎn)多種酶特性的微生物在煙絲發(fā)酵過程中，可通過降解煙葉中的蛋白質、淀粉、纖維素和果膠等大分子物質，生成糖類和氨基酸等產(chǎn)物，在后續(xù)煙絲加熱干燥過程中，煙絲中的糖類和氨基酸可作為反應底物經(jīng)由美拉德反應[20]使得如糠醇、糠醛、2-環(huán)戊烯-1,4-二酮、麥芽酚等[21]具香味的美拉德反應產(chǎn)物含量增加。并且醇類、酯類、萜烯類和稠環(huán)芳烴類[22]等不同化合物含量的增加，共同促進了煙葉香氣品質的提升。同時，由于蛋白質、淀粉、纖維素和果膠等大分子物質的降解，使得煙葉在燃燒時焦油釋放量降低，也減少了煙氣中如NH3、HCN、B[a]P、苯酚和巴豆醛等重點有害物質[18,19]生成量，降低了煙氣危害性。

綜上所述，筆者研究的具有同時產(chǎn)多種酶能力的微生物及其復合微生物配方可通過上述途徑，使得煙氣中各類香味成分含量明顯增加、有害物質含量降低，這對提高煙葉感官質量、改善煙葉品質、降低有害成分釋放起到了重要作用。筆者研究不僅為煙草微生物技術發(fā)展提供新的微生物資源，也為煙草微生物發(fā)酵增香減害技術的發(fā)展提供了重要依據(jù)。