孫 潔 劉菊蓮 王磊剛 胡登吉

（寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司 寧夏·青銅峽 751600）

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）是一種好氧菌，屬于革蘭氏陽性菌，具有良好的耐酸堿、耐高溫等特性?？莶菅挎邨U菌作為植物病害生防細(xì)菌之一，具有較強(qiáng)的防病作用，在極端的條件下，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源性孢子[1]?？莶菅挎邨U菌具有孢子休眠期、生殖生長(zhǎng)期兩個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，會(huì)在生長(zhǎng)環(huán)境惡劣、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等不適宜的環(huán)境下進(jìn)入孢子休眠期，并形成具有極強(qiáng)抗逆作用，在高溫、酸堿等極性環(huán)境下亦可生存的芽孢，從而適應(yīng)環(huán)境得以生存，一旦環(huán)境變得適宜生長(zhǎng)、營養(yǎng)充足，芽孢會(huì)自動(dòng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期，芽孢重新生長(zhǎng)為枯草芽孢桿菌[2]。

枯草芽孢桿菌可作為生物農(nóng)藥投入到植物病害應(yīng)用中，可以防治作物多種真菌病害[3]。能夠提高農(nóng)作物抗病能力，尤其能防治根瘤病、寄生蟲、土壤線蟲病等，為細(xì)菌繁殖抑制菌提供生長(zhǎng)環(huán)境，使病菌、蟲卵在土壤中自然地被除掉[4]。具有一定的固氮、解磷、解鉀作用，可以促使土壤中的有機(jī)質(zhì)分解成腐殖質(zhì)，刺激作物生長(zhǎng)，平衡土壤pH值，調(diào)節(jié)植物根系生態(tài)環(huán)境，形成優(yōu)勢(shì)菌落，防止土傳病蟲害，解除化肥、農(nóng)藥及有害因子對(duì)土壤的破壞，克服連作障礙[5]。

通過對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行不同條件的處理，探究影響枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的因素，為微生物菌劑和生物有機(jī)肥產(chǎn)品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌（寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司研發(fā)）、巨大芽孢桿菌（外購產(chǎn)品）、營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）、5%NaOH水溶液、5%HCl水溶液等。

pH計(jì)、溫度計(jì)、恒溫水浴鍋、Φ90mm玻璃培養(yǎng)、立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS）、恒溫?fù)u床（HNY-2102C）、恒溫培養(yǎng)箱（MHP-100）、凈化工作臺(tái)（JJ-CJ-2FD）等。

1.2 方法

1.2.1 滅菌水的制備：將去離子水加入1000ml三角瓶中，塞上棉花塞，用報(bào)紙包好瓶口，121℃滅菌20min，取出后冷卻備用。

1.2.2 不同pH枯草芽孢桿菌菌液的配制：分別稱取1.0g枯草芽孢桿菌菌劑加入100ml滅菌水中，加入少量滅菌的玻璃珠，用5%NaOH、5%HCl溶液將菌液 pH 分別調(diào)節(jié)至 3、5、7、9、11 五個(gè)梯度，搖勻后室溫下保存。每7日測(cè)定一次有效活菌數(shù)。

1.2.3 不同溫度處理的枯草芽孢桿菌菌液的配制：分別稱取1.0g枯草芽孢桿菌菌劑加入100ml滅菌水中，加入少量滅菌的玻璃珠搖勻，設(shè)置20℃、30℃、40℃、50℃、60℃五個(gè)溫度梯度。將菌液置于水浴中緩慢加熱，加熱至目標(biāo)溫度時(shí)立即從水浴中取出，自然冷卻。室溫下靜置過夜后測(cè)定其有效活菌數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)基平板制備方法：稱取33.0g營養(yǎng)瓊脂，加入1000ml去離子水中，加熱攪拌溶解后分裝，于121℃滅菌20min，取出冷卻至60℃左右。將培養(yǎng)基倒入φ90mm的培養(yǎng)皿中，厚度約為3～5mm，冷卻凝固后備用。

1.2.5 有效活菌數(shù)的測(cè)定方法：取10ml均勻菌液加入滅菌后帶玻璃珠、具棉塞的500ml三角瓶中，加入90ml滅菌水，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分震蕩30min，即得基礎(chǔ)母液。用無菌刻度吸管吸取5.0ml上述母液，加入45ml無菌水，按1∶10進(jìn)行系列稀釋，分別得到 1∶1×101、1∶1×102、1∶1×103、1∶1×104……稀釋的菌懸液。

每個(gè)樣品取三個(gè)連續(xù)的稀釋度，分別取不同稀釋度的菌懸液0.1ml，加到預(yù)先制備好的培養(yǎng)基平板上，分別用無菌涂布器涂布均勻。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，并以無菌水做空白對(duì)照。于37℃培養(yǎng)過夜，第二天以出現(xiàn)20～300個(gè)菌落數(shù)的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)有效活菌數(shù)目。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在20～300個(gè)之間時(shí)，則以該稀釋度平均菌落數(shù)計(jì)算。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20～300個(gè)之間時(shí)，應(yīng)按兩個(gè)稀釋度菌落總數(shù)之比值決定。若其比值≤2，則應(yīng)計(jì)算兩者的平均數(shù)，若比值≥2則以稀釋度小的菌落平均數(shù)計(jì)算[6]。

式中：

nv—體積有效活菌數(shù)，單位為億每毫升（億/ml）；

X—菌落平均數(shù)，單位為個(gè)；

k—稀釋倍數(shù)；

V1—基礎(chǔ)液體積，單位為毫升（ml）；

V2—菌液加入量，單位為毫升（ml）；

V0—樣品量，單位為毫升（ml）。

1.2.6 枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的拮抗實(shí)驗(yàn)：用打孔器取濾紙片，裝入玻璃瓶中，121℃滅菌20min，取出后烘干并冷卻。稱取0.1g枯草芽孢桿菌，加入100ml滅菌水中，搖勻，稱取0.1g巨大芽孢桿菌，搖勻后加入100ml滅菌水中，加入滅菌的濾紙片浸泡30min。取0.1ml均勻的枯草芽孢桿菌加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器涂布均勻，取浸泡了巨大芽孢桿菌菌液的濾紙片，揮干水分，貼于培養(yǎng)基平板上，4℃擴(kuò)散1h，于37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.3 數(shù)據(jù)與分析

運(yùn)用MicrosoftExcel應(yīng)用程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH條件對(duì)枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

表1 不同pH條件對(duì)枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響（億/ml）Table.1 Effect of different pH conditions on colony-forming unit of bacillus subtilis（108CFU/ml）

由表1可以看出，pH為5時(shí)菌液中枯草芽孢桿菌含量最高，pH為3時(shí)次之，pH7、pH9低于pH3，pH為11時(shí)菌液中枯草芽孢桿菌含量最低。隨著時(shí)間的推移，pH為3、5、7、9的菌液中枯草芽孢桿菌的數(shù)量先增加，達(dá)到一定的數(shù)量后開始下降；pH為11的菌液中枯草芽孢桿菌數(shù)量先增加，達(dá)到一定數(shù)量后開始連續(xù)下降。第一天測(cè)定的有效活菌數(shù) pH5＞pH3＞pH7＞pH9＞pH11，菌液中的枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)開始增長(zhǎng)，在第14天測(cè)定時(shí)數(shù)量達(dá)到峰值，其中 pH5＞pH7＞pH3＞pH9＞pH11，之后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，28 天測(cè)定的有效活菌數(shù) pH5＞pH7＞pH3＞pH9＞pH11，但 pH 為11時(shí)其菌液中枯草芽孢桿菌數(shù)量下降幅度較大。這說明本品種枯草芽孢桿菌在pH為3～7的條件下生長(zhǎng)旺盛，在pH為5時(shí)有效活菌數(shù)最高。

2.2 不同溫度條件對(duì)枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

表2 不同溫度條件對(duì)枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響Table.2 Effect of different temperature conditions on colony-forming unitof bacillus subtilis

由表 2可見，其有效活菌數(shù)20℃＞30℃＞40℃＞50℃＞60℃，隨著溫度的上升，有效活菌數(shù)逐漸降低，當(dāng)溫度在20～40℃之間時(shí)，枯草芽孢桿菌存活率＞90%，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，枯草芽孢桿菌存活率僅為66.67%。這說明在20～40℃范圍內(nèi)本試驗(yàn)所使用的枯草芽孢桿菌可以保持90%以上的活性。

2.3 枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌之間的拮抗作用

由圖1可見，培養(yǎng)基平板上的濾紙片周圍產(chǎn)生了抑菌圈，抑菌圈平均直徑為17.6cm，本試驗(yàn)所用的枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌之間會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，故在產(chǎn)品復(fù)配時(shí)，兩種菌劑不能摻混，否則會(huì)有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

不同pH和溫度條件會(huì)對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生較為明顯的作用。本研究表明，pH在3～7時(shí)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)相對(duì)旺盛，其中pH為5時(shí)有效活菌數(shù)最高，這與楊峰等[6]枯草芽孢桿菌在弱酸性和中性環(huán)境中生長(zhǎng)旺盛的結(jié)論較為接近；當(dāng)溫度在20～40℃時(shí)，本試驗(yàn)所使用的枯草芽孢桿菌存活率達(dá)到90%以上。另外，通過研究表明，本實(shí)驗(yàn)所使用的枯草芽孢桿菌會(huì)和巨大芽孢桿菌產(chǎn)生拮抗作用，故二者不適合摻混。

綜上所述，本試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌適宜生長(zhǎng)的pH條件為3～5，適宜生長(zhǎng)的溫度為20～40℃，同時(shí)與巨大芽孢桿菌存在拮抗作用。這對(duì)后期研發(fā)生物有機(jī)肥、復(fù)合生物有機(jī)肥及復(fù)合生物菌劑提供了一定的參考依據(jù)。