李浩賢 林華慶 李俊健 王遠(yuǎn)見(jiàn) 劉榮 余楚欽

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定奧美沙坦酯氫氯噻嗪片中4種已知有關(guān)物質(zhì)（奧美沙坦、奧美沙坦酯二聚體、奧美沙坦酯烯、苯并噻二嗪雜質(zhì)，簡(jiǎn)稱(chēng)雜質(zhì)A、B、C、D）的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）-加校正因子的主成分自身對(duì)照法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為YMC-Triart C8;流動(dòng)相A為乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（70 ∶ 30，V/V），流動(dòng)相B為乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（15 ∶ 85，V/V），梯度洗脫;流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm;柱溫為25 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：雜質(zhì)A、B、C、D的校正因子分別為1.42、1.17、0.89、0.92。奧美沙坦酯、氫氯噻嗪和雜質(zhì)A、B、C、D的質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為0.252 7～7.580 0、1.152 1～4.562 9、0.244 0～18.299 0、0.244 7～3.670 8、0.265 2～3.978 3、? 0.149 9～4.497 3 μg/mL（r均不低于0.999 7），檢測(cè)限分別為0.084 2、0.050 7、0.081 3、0.081 6、0.088 4、0.050 0 μg/mL，定量限分別為0.252 7、0.152 1、0.244 0、0.244 7、0.265 2、0.149 9 μg/mL，中間精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果均符合相關(guān)要求，平均回收率分別為104.00%～108.04%、102.00%～104.94%、100.99%～106.89%、92.00%～95.18%、102.00%～105.06%、103.90%～107.00%（n=3）。3批奧美沙坦酯氫氯噻嗪片中雜質(zhì)A的含量為0.90%～1.00%，雜質(zhì)B的含量為0～0.11%，雜質(zhì)D的含量為0.16%～0.24%，雜質(zhì)C及其余雜質(zhì)未檢出;所建立方法測(cè)得結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)得結(jié)果無(wú)明顯差異。結(jié)論：本方法靈敏度高、重復(fù)性好，可用于奧美沙坦酯氫氯噻嗪片中4種已知有關(guān)物質(zhì)含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 奧美沙坦酯氫氯噻嗪片;有關(guān)物質(zhì);高效液相色譜法;加校正因子的主成分自身對(duì)照法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of four known related substances （olmesartan， olmesartan ester dimer， olmesartan ester alkene， benzothiadiazine impurity， called impurity A， B， C， D for short） in Olmesartan medoxomil hydrochlorothiazide tablets.? METHODS： HPLC-principal component self-control with correction factor were adopted. The determination was performed on YMC-Triart C8 column with mobile phase A consisted of acetonitrile- 0.015 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （pH adjusted to 2.8 with phosphoric acid） （70 ∶ 30， V/V）， mobile phase B consisted of acetonitrile-0.015 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （pH adjusted to 2.8 with phosphoric acid） （15 ∶ 85， V/V） at the flow rate of 0.8 mL/min （gradient elution）. The detection wavelength was set at 265 nm， and column temperature was 25 ℃. The temperature of injector was 4 ℃; the injection volume was 10 μL. RESULTS： The correction factors of impurity A， B， C， D were 1.42， 1.17， 0.89， 0.92， respectively. The linear range of olmesartan medoxomil， hydrochlorothiazide and impurity A， B， C， D were 0.252 7-7.580 0， 1.152 1-4.562 9， 0.244 0-18.299 0， 0.244 7-3.670 8， 0.265 2-3.978 3 and 0.149 9-4.497 3 μg/mL （r≥ 0.999 7）， respectively. The limits of detection were 0.084 2， 0.050 7， 0.081 3， 0.081 6， 0.088 4， 0.050 0 μg/mL， respectively. The quantitative limits were 0.252 7， 0.152 1， 0.244 0， 0.244 7， 0.265 2 and 0.149 9 μg/mL， respectively. The results of intermediate precision， stability （24 h） and repeatability tests all met the relevant requirements. The average recovery rates were 104.00%-108.04%， 102.00%-104.94%， 100.99%-106.89%， 92.00%-95.18%， 102.00%-105.06%， 103.90%-107.00% （n=3）， respectively. The contents of impurity A， B and D in 3 batches of Olmesartan medoxomil hydrochlorothiazide tablets were 0.90%-1.00%， 0-0.11%，0.16%-0.24%， respectively. The impurity C and other impurities were not detected. There is no significant difference between the results measured by the established method and by the external standard method. CONCLUSIONS： The method has been proved to be highly sensitive and reproducible. It can be used to simultaneously determine four known substances in Olmesartan medoxomil hydrochlorothiazide tablets.

KEYWORDS Olmesartan medoxomil hydrochlorothiazide tablets; Related substances; HPLC; Principal component self-control with correct factor

奧美沙坦酯氫氯噻嗪片作為治療高血壓的二線(xiàn)藥物，于2010年在我國(guó)獲批上市[1]，主要活性成分為奧美沙坦酯和氫氯噻嗪。奧美沙坦酯在胃腸道水解成活性成分奧美沙坦后發(fā)揮降壓的作用[2-3];氫氯噻嗪通過(guò)增加鈉、鉀、氯離子與水的排泄，從而減小血容量[4]，增強(qiáng)奧美沙坦酯的降壓效果。在奧美沙坦酯氫氯噻嗪片的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中（簡(jiǎn)稱(chēng)“標(biāo)準(zhǔn)”）明確提及，需對(duì)該制劑中4種已知有關(guān)物質(zhì)奧美沙坦（簡(jiǎn)稱(chēng)“雜質(zhì)A”）、奧美沙坦酯二聚體（簡(jiǎn)稱(chēng)“雜質(zhì)B”）、奧美沙坦酯烯（簡(jiǎn)稱(chēng)“雜質(zhì)C”）和苯并噻二嗪雜質(zhì)A（簡(jiǎn)稱(chēng)“雜質(zhì)D”）進(jìn)行控制[5]。其中，雜質(zhì)A是奧美沙坦酯合成過(guò)程中的中間體殘留，也可因奧美沙坦酯的酯鍵穩(wěn)定性差而降解產(chǎn)生;雜質(zhì)B與雜質(zhì)C均為奧美沙坦酯的潛在降解雜質(zhì);雜質(zhì)D是氫氯噻嗪的合成中間體，同時(shí)也是氫氯噻嗪不穩(wěn)定的降解產(chǎn)物，其含量高低會(huì)影響藥品的穩(wěn)定性和不良反應(yīng)[6-8]。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定該藥中的有關(guān)物質(zhì)，但該法靈敏度與分離度相對(duì)較差[5]。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于該復(fù)方制劑臨床療效的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但對(duì)其有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且其測(cè)定方法仍存在不足。比如，趙建峰[1]雖然建立了該復(fù)方制劑的有關(guān)物質(zhì)分析方法，但僅討論了2種有關(guān)物質(zhì)，也并未對(duì)有關(guān)物質(zhì)的定量方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，且采用外標(biāo)法定量，成本較高。又如，?；鄣萚9]雖采用超臨界色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定了該復(fù)方制劑中6種有關(guān)物質(zhì)的含量，但所需儀器設(shè)備要求較高，難以普及。加校正因子的主成分自身對(duì)照法，是以主成分作為對(duì)照的內(nèi)標(biāo)法，結(jié)合建立方法時(shí)測(cè)定的相對(duì)校正因子，能夠準(zhǔn)確測(cè)定已知有關(guān)物質(zhì)的含量，可彌補(bǔ)現(xiàn)有研究的不足。因此，本研究擬建立HPLC-加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)奧美沙坦酯氫氯噻嗪片中4種已知有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，提高該藥品分析方法的靈敏度、可靠性，以期能更為科學(xué)、有效地控制該復(fù)方制劑中的有關(guān)物質(zhì)含量，進(jìn)一步加強(qiáng)該藥品的質(zhì)量控制。4種已知有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式詳見(jiàn)圖1。

1 材料

1.1 儀器

XS204DU型萬(wàn)分之一電子天平、XS205DU型十萬(wàn)分之一電子天平、XP56型百萬(wàn)分之一電子天平、FE-28型pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多儀器廠）;LC2030C型HPLC儀（日本島津公司）;VD23型真空干燥箱（德國(guó)賓得公司）;SHH-200GD-2型光照箱（重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

奧美沙坦酯氫氯噻嗪片（廣州玻思韜控釋藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為18OH029、18OH030、18OH041、18OH042，規(guī)格：含40 mg奧美沙坦酯、25 mg氫氯噻嗪）;奧美沙坦酯對(duì)照品（批號(hào)：WRS170601，純度：99.9%）、雜質(zhì)A對(duì)照品（批號(hào)：WRS170701，純度：99.4%）、雜質(zhì)C對(duì)照品（批號(hào)：IRS170701，純度：94.0%）購(gòu)自浙江天宇藥業(yè)有限公司;氫氯噻嗪對(duì)照品（常州制藥廠有限公司，批號(hào)：RS18002，純度：99.5%）;雜質(zhì)B對(duì)照品（美國(guó)Cato公司，批號(hào)：90-12-2，純度：98.4%）;雜質(zhì)D對(duì)照品（批號(hào)：JOL279，純度：99%）、氯噻嗪對(duì)照品（批號(hào)：IOL188，純度：99.6%）購(gòu)自上海赫淳生物科技有限公司;5-氯氫氯噻嗪對(duì)照品（批號(hào)：2-ZAM-51-3，純度：98%）、氫氯噻嗪二聚體對(duì)照品（批號(hào)：2-CGF-118-7，純度：97.24%）購(gòu)自加拿大TRC公司;乙腈（美國(guó)BCR公司，色譜純）;其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Triart C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（70 ∶ 30，V/V），流動(dòng)相B為乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（15 ∶ 85，V/V），梯度洗脫;流速：0.8 mL/min;檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm;柱溫：25 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序詳見(jiàn)表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 主成分混合對(duì)照品溶液 取奧美沙坦酯對(duì)照品約12.5 mg、氫氯噻嗪對(duì)照品約7.5 mg，置于同一量瓶中，精密稱(chēng)定，加70%乙腈溶解并制成奧美沙坦酯質(zhì)量濃度為0.05? mg/mL、氫氯噻嗪質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL的主成分混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 雜質(zhì)對(duì)照品溶液 稱(chēng)取雜質(zhì)A對(duì)照品約12 mg、雜質(zhì)B對(duì)照品約2.4 mg、雜質(zhì)C對(duì)照品約5.6 mg、雜質(zhì)D對(duì)照品約6 mg，置于不同量瓶中，精密稱(chēng)定，分別用70%乙腈制成質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的雜質(zhì)A對(duì)照品溶液、0.024? mg/mL的雜質(zhì)B對(duì)照品溶液、0.028 mg/mL的雜質(zhì)C對(duì)照品溶液以及0.03 mg/mL的雜質(zhì)D對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取3片奧美沙坦酯氫氯噻嗪片，置于250 mL量瓶中，加入70%乙腈適量，待樣品崩解分散后，超聲（功率：250 W，頻率：70 kHz）振搖5 min，用70%乙腈稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm尼龍濾膜濾過(guò)，棄去初濾液5 mL，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 自身對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液適量，用70%乙腈稀釋100倍，即得。

2.2.5 空白輔料溶液 按奧美沙坦酯氫氯噻嗪片制劑處方，稱(chēng)取各輔料適量（約相當(dāng)于3片奧美沙坦酯氫氯噻嗪片所含輔料量），混勻，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備空白輔料溶液。

2.2.6 系統(tǒng)適用性溶液 取雜質(zhì)A對(duì)照品12 mg、雜質(zhì)B對(duì)照品2.4 mg、雜質(zhì)C對(duì)照品2.9 mg、奧美沙坦酯對(duì)照品5 mg和氫氯噻嗪、雜質(zhì)D、氯噻嗪、5-氯氫氯噻嗪、氫氯噻嗪二聚體對(duì)照品各3 mg，置于同一量瓶中，用70%乙腈稀釋制成雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、奧美沙坦酯質(zhì)量濃度分別為0.012、0.002 4、0.002 9、0.005 mg/mL以及氫氯噻嗪、雜質(zhì)D、氯噻嗪、5-氯氫氯噻嗪、氫氯噻嗪二聚體質(zhì)量濃度均為0.003 mg/mL的系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2.5”項(xiàng)下的空白輔料溶液與“2.2.6”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白輔料在各成分出峰處無(wú)干擾，主成分及各雜質(zhì)峰間分離度均大于2.0，理論板數(shù)按奧美沙坦酯和氫氯噻嗪計(jì)均大于3 000，奧美沙坦酯、氫氯噻嗪和雜質(zhì)A、B、C、D的保留時(shí)間分別為39.60、13.14、25.80、42.52、44.73、9.99 min?？芍?，氫氯噻嗪、氯噻嗪、5-氯氫氯噻嗪、氫氯噻嗪二聚體這幾個(gè)制劑中的已知雜質(zhì)在未得到控制的情況下，也不會(huì)影響本研究中4種已知雜質(zhì)的定量檢測(cè)，本方法具有較好的系統(tǒng)適用性。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的色譜圖詳見(jiàn)圖2。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：18OH029）奧美沙坦酯氫氯噻嗪片20片，研細(xì)，取520 mg細(xì)粉，精密稱(chēng)定，置于100 mL量瓶中，平行稱(chēng)取6份。1份不作處理，另外5份分別進(jìn)行酸、堿、氧化、高溫和光照破壞。（1）酸破壞：加入0.01 mol/L鹽酸溶液10 mL，室溫放置20 min;（2）堿破壞：加入0.01 mol/L 氫氧化鈉溶液10 mL，室溫放置15 min;（3）氧化破壞：加入3%過(guò)氧化氫溶液10 mL，室溫放置4 h;（4）高溫破壞：將細(xì)粉放入80 ℃烘箱中放置24 h，取出，冷卻至室溫;（5）光照破壞：將細(xì)粉置于光照箱中（5 000 lx），24 h后取出。將上述6種樣品（酸、堿破壞樣品均經(jīng)過(guò)中和）分別用70%乙腈稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，棄去初濾液5 mL，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各破壞條件下輔料對(duì)本品中4種有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)均無(wú)干擾，供試品溶液中各成分峰均能有效分離;本品在光照條件下較穩(wěn)定;在高溫破壞條件下，本品中已知雜質(zhì)含量無(wú)明顯增長(zhǎng)，但產(chǎn)生了2個(gè)未知雜質(zhì);在酸、堿、氧化破壞條件下，本品中已知雜質(zhì)A、D的含量均明顯增加，尤其是在酸、堿破壞條件下，雜質(zhì)A、D的含量增加尤為明顯，且均產(chǎn)生了1個(gè)未知雜質(zhì)。專(zhuān)屬性試驗(yàn)的色譜圖詳見(jiàn)圖3。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別量取 “2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液適量，用70%乙腈分別制備成定量限濃度和相當(dāng)于雜質(zhì)限度20%、50%、100%、120%、150%的系列線(xiàn)性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制曲線(xiàn)，采用最小二乘法進(jìn)行線(xiàn)性回歸。以方程斜率（K）計(jì)算校正因子（f）：f=K主成分/K雜質(zhì)。結(jié)果顯示，奧美沙坦酯、氫氯噻嗪和雜質(zhì)A、B、C、D的質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為0.252 7～7.580 0、0.152 1～4.562 9、0.244 0～18.299 0、0.244 7～3.670 8、0.265 2～3.978 3、0.149 9～4.497 3? ? ? μg/mL。雜質(zhì)A、B、C相對(duì)于奧美沙坦酯的校正因子分別為1.42、1.17、0.89，雜質(zhì)D相對(duì)于氫氯噻嗪的校正因子為0.92。線(xiàn)性關(guān)系及校正因子考察結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.6 檢測(cè)限和定量限考察

分別取“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液適量，用逐步稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)信噪比為3 ∶ 1、10 ∶ 1時(shí)分別得檢測(cè)限和定量限。結(jié)果，奧美沙坦酯、氫氯噻嗪和雜質(zhì)A、B、C、D的檢測(cè)限分別為0.084 2、0.050 7、0.081 3、0.081 6、0.088 4、0.050 0 μg/mL，定量限分別為0.252 7、0.152 1、0.244 0、0.244 7、0.265 2、0.149 9 μg/mL。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.6”項(xiàng)下方法制備溶液，共6份，然后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示，奧美沙坦酯、氫氯噻嗪、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D含量的RSD分別為0.83%、1.21%、0.99%、1.42%、0.61%、1.04%（n=6），表明該法重復(fù)性良好。

2.8 中間精密度試驗(yàn)

兩位分析人員分別在不同時(shí)間（2 d）使用相同品牌、規(guī)格的不同色譜柱和HPLC儀進(jìn)行操作。按“2.2.6”項(xiàng)下方法制備溶液，各6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，12份樣品中各成分峰面積的RSD均小于2.00%（n=12），表明該方法中間精密度良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

按樣品處方精密稱(chēng)取空白輔料適量，共9份，置于不同體積的量瓶中，分別加入“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下溶液適量，用70%乙腈分別稀釋為R1溶液（濃度相當(dāng)于雜質(zhì)限度的50%）、R2溶液（濃度相當(dāng)于雜質(zhì)限度的100%）和R3溶液（濃度相當(dāng)于雜質(zhì)限度的150%），各濃度溶液平行制備3份。分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算各成分的平均回收率。結(jié)果顯示，R1、R2、R3溶液中各成分的平均回收率在92%～108%范圍內(nèi)，RSD均小于2.00%（n=3），表明該方法準(zhǔn)確度較好?；厥章试囼?yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表3。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.9”項(xiàng)下回收率試驗(yàn)中R2溶液，分別于常溫和6 ℃條件下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，該溶液在室溫下放置24 h時(shí)不穩(wěn)定，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B峰面積的RSD分別為5.2%、6.4%（n=6），其余4種成分峰面積的RSD均小于2.0%（n=6）;在6 ℃條件下，該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，6種成分峰面積的RSD均小于2.0%（n=6）。

2.11 耐用性試驗(yàn)

取“2.9”項(xiàng)下回收率試驗(yàn)中R2溶液，在其他色譜條件不變的情況下，分別考察流動(dòng)相B不同組成比例[乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫鉀溶液（13 ∶ 87、15 ∶ 85、17 ∶ 83，V/V）]、不同流速（0.6、0.8、1.0 mL/min）、不同柱溫（20、25、30 ℃）對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，并計(jì)算各成分的回收率。結(jié)果，各種條件下系統(tǒng)適用性均符合要求，3種變化條件下（各平行2次）各成分回收率的RSD均小于2.00%（n=6），表明該方法耐用性良好。耐用性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)詳表4。

2.12 樣品中4種有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)：18OH030、18OH041、18OH042），按“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和自身對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并分別按加校正因子的主成分自身對(duì)照法與外標(biāo)法計(jì)算各雜質(zhì)的含量。每個(gè)樣品平行2份，取均值。結(jié)果，按加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)得的3批樣品中雜質(zhì)A含量為0.90%～1.00%、雜質(zhì)B含量為0.07%～0.11%（批號(hào)為18OH030的樣品中未檢出）、雜質(zhì)D含量為0.16%～0.24%，雜質(zhì)C及其他雜質(zhì)未檢出，與按外標(biāo)法測(cè)得結(jié)果基本相同。奧美沙坦酯氫氯噻嗪片中4種有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 含量測(cè)定方法的考察

本研究利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定各雜質(zhì)的校正因子，將樣品供試品溶液稀釋100倍后作為自身對(duì)照，采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法[10-13]計(jì)算4種有關(guān)物質(zhì)含量，所得的結(jié)果與外標(biāo)法所得結(jié)果相比無(wú)明顯差異，表明相對(duì)校正因子的計(jì)算準(zhǔn)確。將測(cè)得的相對(duì)校正因子載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可供常規(guī)檢驗(yàn)使用，能降低因主成分與雜質(zhì)的絕對(duì)校正因子不同引起的測(cè)定誤差，且無(wú)需長(zhǎng)期使用雜質(zhì)對(duì)照品，可代替外標(biāo)法準(zhǔn)確測(cè)定已知有關(guān)物質(zhì)的含量。同時(shí)，該法克服了面積歸一化法中微量雜質(zhì)與主成分可能不在同一線(xiàn)性范圍內(nèi)而造成的誤差[14]，故能準(zhǔn)確測(cè)定微量雜質(zhì)含量。此外，對(duì)于未知雜質(zhì)，由于無(wú)法獲得對(duì)照品，考慮到其結(jié)構(gòu)通常與主成分相似，其校正因子通常默認(rèn)為1.00進(jìn)行計(jì)算，故該法對(duì)未知雜質(zhì)含量的計(jì)算存在一定誤差。

3.2 色譜條件的考察

筆者在前期試驗(yàn)中主要考察了流速、檢測(cè)波長(zhǎng)和進(jìn)樣量對(duì)色譜分析的影響。（1）流速的考察：當(dāng)選擇流速為1.0 mL/min時(shí)，雜質(zhì)B與雜質(zhì)C的分離度僅為1.529，剛達(dá)到基線(xiàn)分離;當(dāng)流速調(diào)整為0.8 mL/min時(shí)，兩者的分離度提高至2.973，分離效果有明顯改善，且各成分均有良好的峰形和分離度，故確定流速為0.8 mL/min。（2）檢測(cè)波長(zhǎng)的考察：標(biāo)準(zhǔn)中，該藥有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的波長(zhǎng)為250 nm[5]，但在試驗(yàn)過(guò)程中筆者發(fā)現(xiàn)，該波長(zhǎng)下氫氯噻嗪響應(yīng)值較低，影響了測(cè)定過(guò)程中對(duì)氫氯噻嗪色譜峰的處理與計(jì)算。筆者通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，并參考本課題組前期建立的該藥主成分含量測(cè)定方法，選定檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。在該檢測(cè)波長(zhǎng)下，氫氯噻嗪與奧美沙坦酯的響應(yīng)值相當(dāng)，且各成分均有較好的響應(yīng)值。（3）進(jìn)樣量的考察：筆者比較了5、10、20 μL進(jìn)樣量對(duì)色譜分離情況的影響。結(jié)果顯示，以5 μL為進(jìn)樣量時(shí)，分離度良好，但主峰的峰高過(guò)低，定量限溶液的信噪比低于10，難以準(zhǔn)確定量;以20 μL為進(jìn)樣量時(shí)，分離度有所下降，且檢出雜質(zhì)過(guò)多，不利于對(duì)主要成分和已知雜質(zhì)進(jìn)行分析;而以10 μL為進(jìn)樣量時(shí)，各成分均能達(dá)到較好的分離和檢驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，本研究建立了HPLC-加校正因子的主成分自身對(duì)照法用于測(cè)定奧美沙坦酯氫氯噻嗪片中4種已知有關(guān)物質(zhì)的含量。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，能同時(shí)測(cè)定該復(fù)方制劑中4種已知有關(guān)物質(zhì)的含量，可為該藥的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供一定的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-10-23 修回日期：2020-02-05）

（編輯：林 靜）