周高紅 朱偉英 鐘少平

【摘要】 目的 探討早期異位妊娠母體血清Netrin-1檢測的臨床意義。方法 選取擬診早期異位妊娠患者100例作為實(shí)驗(yàn)組， 另選取同期要求終止妊娠的宮內(nèi)早孕患者100例作為對照組。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑檢測兩組患者母體血清Netrin-1表達(dá)水平。比較兩組患者Netrin-1表達(dá)水平， 分析Netrin-1診斷早期異位妊娠臨床診斷閾值。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組患者Netrin-1表達(dá)水平為（80.84±8.66）pg/ml， 顯著低于對照組的（353.00±9.96）pg/ml， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Netrin-1濃度診斷早期異位妊娠的受試者工作特征曲線（ROC）曲線下面積的95%可信區(qū)間為（0.911， 0.977）。據(jù)Youdens index計算Netrin-1臨床診斷閾值為226.50 pg /ml， 即Netrin-1濃度≤226.50 pg /ml考慮早期異位妊娠可能性大。結(jié)論 早期異位妊娠患者血清Netrin-1表達(dá)顯著降低， 考慮可能與異位妊娠患者絨毛血管形成受阻有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 Netrin-1;早期異位妊娠;血清

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.08.087

【Abstract】 Objective? ?To investigate the significance of Netrin-1 detection in maternal serum of early ectopic pregnancy. Methods? ?There were 100 cases of early ectopic pregnancy selected as the experimental group and another 100 cases of early intrauterine pregnancy requiring termination of pregnancy as the control group. The expression of Netrin-1 in maternal serum of the two groups was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression level of Netrin-1 was compared between the two groups， and the clinical diagnostic threshold of Netrin-1 in the diagnosis of early ectopic pregnancy was analyzed. Results? ?The expression level of Netrin-1 in the experimental group was （80.84±8.66） pg/ml， which was significantly lower than （353.00±9.96） pg/ml in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The 95% confidence interval of the area under the receiver operating characteristic （ROC） curve for subjects with Netrin-1 concentration in the diagnosis of early ectopic pregnancy was （0.911， 0.977）. According to Youdens index， the clinical diagnosis threshold of Netrin-1 was 226.50 pg/ml， that was， the concentration of Netrin-1?≤226.50 pg/ml was very likely to consider early ectopic pregnancy. Conclusion? ?The expression of Netrin-1 in serum of patients with early ectopic pregnancy was significantly decreased， which may be related to the obstruction of villous angiogenesis in patients with ectopic pregnancy.

【Key words】 Netrin-1; Early ectopic pregnancy; Serum

隨著社會的發(fā)展， 不孕癥患者日益增多， 相應(yīng)導(dǎo)致輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用亦相應(yīng)增多， 從而異位妊娠發(fā)生率相應(yīng)升高。此外， 由于目前二胎政策的放開， 保留生殖能力日益引起人們的重視， 早期異位妊娠（ectopie pregnancy）（孕4～5周）保守治療治愈率高， 再生育率增加。因此目前早期異位妊娠的確診尤顯重要。由于早期異位妊娠臨床表現(xiàn)不明顯， 診斷較困難， 在診斷不明的情況下是繼續(xù)維持先兆流產(chǎn)的保胎方案， 還是采用異位妊娠的診療措施， 臨床工作中存在較大爭議， 從而導(dǎo)致異位妊娠患者終止妊娠時孕周偏大， 使得臨床上保守治療效果減弱。在胚泡著床過程中， 滋養(yǎng)細(xì)胞會產(chǎn)生一定相關(guān)血管新生因子維持妊娠[1]。Netrin-1作為一種血管新生因子， 可調(diào)節(jié)胚胎生長發(fā)育。在早期絨毛血管生成和早期胚胎停止發(fā)育的發(fā)病中Netrin-1家族成員可能也起到一定的作用[2]。據(jù)此， 本研究擬通過獲取患者孕早期血清Netrin-1水平確定早期異位妊娠， 從而提高保守治療效果， 提高患者再生育率?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2016年5月～2018年5月就診于本院婦科門診的擬診早期異位妊娠患者100例作為實(shí)驗(yàn)組， 另選擇同期要求終止妊娠的宮內(nèi)早孕患者100例作為對照組。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)， 所有患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：此次妊娠前月經(jīng)周期規(guī)律， 末次月經(jīng)準(zhǔn)確， 無內(nèi)分泌及腫瘤病史， 妊娠后未服用影響胎兒發(fā)育的藥物， 無遺傳疾病， 慢性疾病及傳染病的健康女性;排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠前及妊娠期有寵物接觸史， 孕母有吸煙、酗酒及吸毒史， 多胎妊娠。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。見表1。

1. 2 標(biāo)本的采集與制備 所有患者入組后抽取母體血檢測Netrin-1水平， 離心后血清留置于-80℃冰箱中， 待標(biāo)本收集至少至20份后進(jìn)行檢測， 所有血清標(biāo)本均在3個月內(nèi)檢測完畢， 其中Netrin-1水平ELISA試劑采用Human netrin-1 （Ntn1）ELISA Kit （CUSABIO， 美國）， 檢測儀器采用雷杜 Rayto 酶標(biāo)儀檢測。按照常規(guī)ELISA試劑檢測步驟進(jìn)行檢測。ELISA試劑盒操作步驟：實(shí)驗(yàn)開始前， 提前配置好所有試劑， 試劑或樣品稀釋時均需混勻， 混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋， 以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。①加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μl， 余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl， 注意不要有氣泡， 加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部， 盡量不觸及孔壁， 輕輕晃動混勻， 酶標(biāo)板加上蓋或覆膜， 37℃反應(yīng)120 min。②棄去液體， 甩干， 不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100 μl（取1 μl生物素標(biāo)記抗體加99 μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制， 輕輕混勻， 在使用前1 h內(nèi)配制）， 37℃， 60 min。③溫育60 min后棄去孔內(nèi)液體， 甩干， 洗板3次， 浸泡1～2 min/次，?350 μl/孔， 甩干。④每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100 μl， 37℃， 60 min。⑤溫育60 min后棄去孔內(nèi)液體， 甩干， 洗板5次， 浸泡1～2 min/次， 350 μl/孔， 甩干。⑥依序每孔加底物溶液90 μl， 37℃避光顯色。⑦依序每孔加終止溶液50 μl， 終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性， 底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。⑧用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行檢測。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較兩組患者Netrin-1表達(dá)水平， 分析Netrin-1診斷早期異位妊娠臨床診斷閾值。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn);Netrin-1臨床診斷閾值采用ROC曲線下面積性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果

2. 1 兩組患者Netrin-1表達(dá)水平比較 實(shí)驗(yàn)組患者Netrin-1表達(dá)水平為（80.84±8.66）pg/ml ， 顯著低于對照組的（353.00±9.96）pg/ml， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2. 2 Netrin-1診斷早期異位妊娠臨床診斷閾值? ? Netrin-1濃度診斷早期異位妊娠的ROC曲線下面積的95%可信區(qū)間為（0.911， 0.977）。據(jù)Youden's index計算Netrin-1臨床診斷閾值為226.50 pg/ml， 即Netrin-1濃度≤226.50 pg /ml考慮早期異位妊娠可能性大。

3 討論

異位妊娠是指受精卵在子宮體腔以外著床的妊娠， 是婦科常見的急腹癥， 未及時救治會影響患者預(yù)后， 嚴(yán)重地會導(dǎo)致孕婦死亡。隨著流行病學(xué)變化及診斷技術(shù)的提高， 目前異位妊娠發(fā)病率呈逐漸升高及年輕化趨勢[3， 4]， 如何提高早期異位妊娠診斷率， 尤其是對于需保留輸卵管的孕婦， 減少對女性身心健康損害是目前婦產(chǎn)科醫(yī)師必須面臨的一個重要課題。

最近研究發(fā)現(xiàn)， Netrin-1及其受體在脊椎動物的肺、乳腺、胰腺和血管上皮中均有表達(dá)， 參與組織器官的維持及發(fā)展;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， Netrin-1從屬于Netrins家族， Netrins是一種與層粘蛋白相關(guān)的蛋白家族， 在進(jìn)化過程中具有高度保守性[5]。相關(guān)研究[6]表明， Netrin-1是一種分泌與軸突生長和遷移有關(guān)的蛋白質(zhì)， 其在血管生成及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。從解剖學(xué)和細(xì)胞水平來看， 血管和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生過程具有一定的相似性， 都是多分枝和高度復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。在早孕期間， 胚泡植入后， 細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞便開始不斷增生、融合及侵襲血管， 形成絨毛， 絨毛生長的過程中伴隨著血管的新生， 新生血管發(fā)生過程與滋養(yǎng)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)， 并受到血管新生因子的調(diào)節(jié)， 其中包括了Netrins。研究證實(shí)Netrin-1與促進(jìn)胎盤血管形成及胎盤著床位置有關(guān)[1， 6， 7]， 同時亦可影響胚胎的活力。研究發(fā)現(xiàn)[8， 9]， Netrin-1能促進(jìn)人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲能力。王珺等[2]研究發(fā)現(xiàn)， Netrin-1低表達(dá)與胚胎停止發(fā)育有關(guān)。本研究結(jié)果中， 實(shí)驗(yàn)組患者Netrin-1表達(dá)水平為（80.84±8.66）pg/ml ， 顯著低于對照組的（353.00±9.96）pg/ml， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與文獻(xiàn)報道一致。Netrin-1濃度在診斷異位妊娠及宮內(nèi)早孕的ROC曲線下面積95%可信區(qū)間為（0.911， 0.977）， Netrin-1臨床診斷閾值為226.50 pg/ml， 與臨床診斷相符合， 但因?yàn)樵撗芯恐袠颖玖繛?00例， 樣本量較小， 此外， 有部分宮內(nèi)早孕及早期異位妊娠停經(jīng)時間短， 部分宮內(nèi)早孕超聲下未見卵黃囊及部分早期異位妊娠還沒有超聲異位妊娠部位的改變， 因此， 利用Netrin-1濃度來進(jìn)行早期異位妊娠的臨床診斷可能會有一定誤差及偏倚， 在提高診斷閾值方面尚需大樣本研究來提高早期異位妊娠診斷率。

綜上所述， 胚泡著床及妊娠的維持受到了Netrin-1的調(diào)節(jié)， 當(dāng)Netrin-1水平降低， 滋養(yǎng)細(xì)胞功能受損， 絨毛血管發(fā)生障礙， 異位妊娠發(fā)生可能性加大。

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[收稿日期：2020-01-02]