石維維 陳復(fù)輝

1北京市大興區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科102600;2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科150086

目前肺癌已經(jīng)成為全世界受累人數(shù)最多的惡性腫瘤,其發(fā)病率和病死率持續(xù)居高不下。同時肺癌也是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一,雖然經(jīng)過幾十年的不懈努力,其5年生存率依然不到15%。因此,肺癌的早期診斷及治療成為肺癌研究的重中之重。目前分子生物學(xué)和基因治療的發(fā)展為肺癌的早期診斷和治療提供了新的依據(jù)survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員,具有調(diào)控細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡的作用,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。其在正常組織和分化良好的成人組織未見表達(dá),但在人類胚胎組織和許多惡性腫瘤組織中表達(dá)顯著。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)survivin基因單核苷酸多態(tài)性與人類的許多腫瘤存在相關(guān)性。由此使其成為腫瘤研究的焦點,為腫瘤的早期診斷、基因治療提供了新的靶點。本研究旨在探討survivin基因9194A/G位點單核苷酸多態(tài)性與肺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性,并探討吸煙因素對該位點多態(tài)性產(chǎn)生的影響。

1 對象與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 研究人群 納入2011年3月至2012年4月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科及腫瘤內(nèi)科133例肺癌患者為肺癌組。其中吸煙患者為80例,非吸煙患者為53例。選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心的健康人150名為對照組,其中吸煙者83例,非吸煙者67例,均無癌癥病史和癌癥家族史及其他嚴(yán)重疾病。對照組與肺癌組在性別、年齡構(gòu)成上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05)。本研究經(jīng)受試者知情同意,符合 《赫爾辛基宣言》的原則。

1.1.2 標(biāo)本的收集及保存 采集肺癌組和對照組晨起空腹的外周靜脈血各5 ml,所有采集標(biāo)本均以EDTA抗凝,應(yīng)用氯仿-異戊醇法分離提取外周血基因組DNA,使用50μl TE液溶解DNA,并于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 水平凈化工作臺(SPDJ,上海浦東物理光學(xué)儀器廠),臺式高速冷凍離心機(Neofuge13R,上海力申科學(xué)儀器有限公司),-80℃冰箱(中國海爾公司),普通冷凍冰箱(中國海爾公司),電泳儀(EPS300型,上海天能科技有限公司),凝膠自動成像系統(tǒng)(GI52010,上海天能科技有限公司),1.5 ml Eppendorf管、槍頭、微量加樣器(Eppendorf中國有限公司),溫箱(HW-SY21-K4C,北京長風(fēng)儀器儀表)。

1.1.4 主要試劑及儲存方法 20%SDS;5 mol/L NaCl;氯仿-異戊醇;細(xì)胞裂解液、TE液、無水乙醇均訂購于上海生物工程有限公司,分別存儲于4℃、4℃和室溫陰涼通風(fēng)櫥內(nèi);引物;2%瓊脂糖凝膠;Cfr42I限制性內(nèi)切酶;DNA擴增。

1.2 方法及步驟

1.2.1 外周血基因組DNA提取 取抗凝血500μl置于1.5 ml Ep管,后加入細(xì)胞裂解緩沖液1 ml,充分混合裂解。17 458×g離心5 min,棄去上層液。重復(fù)上述裂解1次。于沉淀物中加入500μl滅菌蒸餾水溶解紅細(xì)胞。17 458×g離心10 min棄 去 上 清 液。 用80μl DNA稀 釋 緩 沖 液(0.375 mol/L NaCI,0.12 mol/L EDTA)將沉淀輕輕重懸。加入15μl 20%SDS、100μl 5 mol/L NaCI充分混均30 s,再加入240μl無菌雙蒸水、350μl氯仿-異戊醇(24∶1體積)混合液充分混均30 s。17 458×g離心3 min,將上清液轉(zhuǎn)至另一Ep管。加入860μl無水乙醇顛倒混均數(shù)次至DNA絮狀物析出。17 458×g離心3 min,棄去上清液,37℃自然干燥。50μl TE溶解DNA備用。

1.2.2 目的基因片段擴增 50μl反應(yīng)體系包括5μl模板DNA、2μl正向引物、2μl反向引物、25μl 2×Taq Master Mix、16μl RNase-Free Water。將其置于PCR儀擴增,擴增條件為:引物 序 列(9194A/G位 點),正 向 引 物:5'-GAAGAAAGAATTTGAGGAAACCGC-3',反向引 物:5'-AAACCCTGGAAGTGGTGCAG-3'。survivin 9194A/G反應(yīng)條件:95℃10 min變性,35個循環(huán)95℃30 s,60℃30 s and 72℃30 s,72℃10 min延伸。抽取DNA樣本檢測。

1.2.3 PCR產(chǎn)物過夜酶切 取10μl PCR反應(yīng)混合物,18μl nuclease-free water,2μl 10×Buffer Tango,2μl Cfr42I配置反應(yīng)體系。將配置好的反應(yīng)體系配平離心后置于浮漂,放置于37℃溫箱恒溫孵育18 h。

1.2.4 酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 取已制備的2%瓊脂糖凝膠,按既定順序?qū)NA ladder 3μl、PCR擴增后的酶切產(chǎn)物5μl依次加入加樣孔。將加樣后的凝膠塊置于水平電泳槽內(nèi),并自行標(biāo)記。將加樣孔一側(cè)置于負(fù)極端,電泳通電電壓設(shè)置200 V,接通電源電泳約20 min后(當(dāng)藍(lán)色條帶電泳到整個膠塊約2/3時)停止電泳。戴上無菌潔凈橡膠手套,將凝膠塊取出并置于凝膠自動成像系統(tǒng)。接通凝膠成像系統(tǒng)電源,打開主機菜單,設(shè)置相關(guān)參數(shù)后,顯像并保存。取出凝膠塊進(jìn)入暗室,將凝膠塊置于紫外線觀察儀上進(jìn)行人工肉眼條帶分類,將分類結(jié)果依次記錄下并與電腦結(jié)果比對,對有異議結(jié)果從新分析分類。并隨機抽取10% DNA樣本送往基因測序公司進(jìn)行基因序列檢測,驗證本試驗真實可靠性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 對照組與肺癌組9194A/G基因采用例數(shù)(百分比)表示,基因表達(dá)差異采用χ2檢驗。按照吸煙程度分層分析,吸煙與基因型的表達(dá)差異采用χ2檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理,雙側(cè)檢驗,α=0.05為檢驗水準(zhǔn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 survivin 9194A/G位點酶切電泳結(jié)果 采用PCR連接的限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù),將目的基因的DNA片段酶切后電泳,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯像。survivin基因在9194位點存在單核苷酸多態(tài)性,共3種基因型:AA型、GG型、AG型(圖1)。

圖1 經(jīng)限制性內(nèi)切酶Cfr42I酶切后凝膠成像圖

2.2 酶切產(chǎn)物基因測序 survivin 9194A/G位點經(jīng)酶切的基因片段產(chǎn)物進(jìn)行基因測序后與電泳結(jié)果對比,結(jié)果符合率98%,數(shù)據(jù)真實可靠。測序后見圖2。

2.3 基因型構(gòu)成情況 對照組與肺癌組survivin 9194A/G位點基因構(gòu)成情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.358,P=0.836),見表1。不同吸煙情況下,肺癌組survivin基因9194A/G位點構(gòu)成情況與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05),見表2。

圖2 經(jīng)酶切的基因片段產(chǎn)物基因測序后與電泳結(jié)果比對,結(jié)果符合率98%,數(shù)據(jù)真實可靠

表1 2組survivin基因9194A/G位點基因型構(gòu)成比分析[例(%)]

3 討論

2017年美國癌癥學(xué)會統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示肺癌仍是全世界發(fā)病率和病死率排名第一的癌癥[1]。我國肺癌發(fā)病率和病死率近10年明顯增高[2],嚴(yán)重威脅著人類的生命健康,并且給家庭社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,關(guān)于肺癌的早期診斷、有效治療及預(yù)后成為全球密切關(guān)注的研究熱點。

survivin是凋亡抑制蛋白家族的一名新成員,被認(rèn)為是目前最強的凋亡抑制因子。survivin結(jié)構(gòu)特殊,其N端含有半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域,相鄰的C端缺少指環(huán)結(jié)構(gòu)[3]。survivin不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期參與細(xì)胞分化,而且能夠抑制細(xì)胞的凋亡,已證實是由抑制蛋白重復(fù)區(qū)序列在凋亡抑制蛋白抑制細(xì)胞中發(fā)揮了抗凋亡作用[4]。其機制為干擾內(nèi)源性凋亡信號通路上游啟動子Caspase-9活化,并直接抑制Caspase-3和Caspase-7[5]。survivin的過表達(dá)可抑制細(xì)胞的凋亡,相反,survivin表達(dá)的降低可導(dǎo)致細(xì)胞的自發(fā)性死亡[6]。survivin表達(dá)具有選擇性,在人類胚胎組織和多種惡性腫瘤組織中見廣泛表達(dá),但在正常組織和終末分化的成人組織中未見表達(dá)。有研究表明其在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用。另外它的表達(dá)可能與一些腫瘤的預(yù)后不良存在相關(guān)性[7]。因此,survivin可能成為一個很好的腫瘤候選易感基因,survivin功能多態(tài)位點可導(dǎo)致腫瘤的易感性。徐美玲等[8]研究表明,survivin基因31G/C位點多態(tài)性與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生有一定相關(guān)性。而位于第四外顯子的非同義survivin 9194A/G多態(tài)性位點功能目前尚未清楚,但可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)。結(jié)合既往相關(guān)文獻(xiàn),本研究選擇了survivin 9194A/G多態(tài)位點,對其進(jìn)行與肺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性研究。同時明確吸煙因素是否參與了這個基因位點多態(tài)性的產(chǎn)生,為肺癌的預(yù)防和診治提供有力依據(jù)。

表2 2組吸煙與survivin 9194A/G位點單核苷酸多態(tài)性分析[例(%)]

國內(nèi)外關(guān)于-9194G/A位點多態(tài)性的研究相對較少。Jang等[9]對582例韓國肺癌患者及528名健康人的病例對照研究發(fā)現(xiàn),survivin基因9194A/G位點多態(tài)性與肺癌的易感性無明顯相關(guān)性。而Kawata等[10]對235例膀胱癌患者和346名健康人進(jìn)行survivin基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn),9194A/G位點G等位基因的出現(xiàn)顯著降低膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險。以C-A單倍體作對照,G-G單倍體可降低膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險。本研究中未發(fā)現(xiàn)survivin 9194A/G位點多態(tài)性與肺癌的易感性存在相關(guān)性,與Jang等[9]的研究結(jié)果相符。這些結(jié)果的差異性可能是因為不同腫瘤的組織來源不同,受基因多態(tài)性的影響程度不盡相同,或者survivin 9194A/G位點多態(tài)性的改變不能夠?qū)е路伟┑牟±砀淖?從而不能對個體的肺癌易感性產(chǎn)生影響。在對survivin基因中的9194A/G位點基因多態(tài)性與吸煙因素的相關(guān)性研究中,本研究未發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與吸煙之間存在關(guān)聯(lián),吸煙因素可能不參與這個位點基因多態(tài)性的產(chǎn)生。

肺癌的發(fā)生和發(fā)展是多基因參與、多種因素、多個步驟和多個階段的分子事件。在本研究中只對survivin基因中的9194A/G位點進(jìn)行了多態(tài)性的研究,未來有必要對這一基因的不同位點進(jìn)行單獨的及聯(lián)合分析,并且以人群為基礎(chǔ),加大樣本量進(jìn)一步證實,為闡明肺癌的發(fā)病機制和為臨床治療開辟新的途徑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突