魏明莉 黃娜

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科610500

肺癌是全球頭號(hào)癌癥殺手,嚴(yán)重威脅著人類的生存健康。2018年Bray等[1]對(duì)全球癌癥數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)表明,肺癌是發(fā)病率和病死率第1位的惡性腫瘤。同時(shí),肺癌的發(fā)病率和病死率居我國(guó)所有惡性腫瘤之首[2]。其中肺腺癌的發(fā)病率越來(lái)越高,是我國(guó)最常見(jiàn)的肺癌病理類型。肺癌是一種基因性疾病,癌基因的激活或抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和凋亡障礙是肺癌發(fā)生的關(guān)鍵,也是癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一[3]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)GRHL2在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用[4-6],但GRHL2在肺癌細(xì)胞中的作用尚未完全明確。為進(jìn)一步闡明GRHL2在肺癌中的作用,本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的GRHL2沉默表達(dá),初步探討GRHL2沉默對(duì)肺癌A549細(xì)胞細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細(xì)胞株及293T細(xì)胞由成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。GRHL2兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,β-actin兔多抗購(gòu)自美國(guó)CST公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司。Annexin V-APC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技公司。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。GRHL2及β-actin引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GRHL2沉默慢病毒穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建根據(jù)Genebank中報(bào)道的人GRHL2基因的核苷酸序列(NM_024915),參照siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)一條19 nt寡核苷酸的特異性siRNA靶序列(5'-TTCAAAGCAGATGAAAGAA-3'),合成sh RNA,sh RNA轉(zhuǎn)錄模板如下。正向引物:5'-CCGGCCTTCAAAGCAGATGAAAGAACTCGAGTTCTTTCATCTGCTTTGAAGGTTTTTG-3',反向引物:5'-AATTCAAAAACCTTCAAAGCAGATGAAAGAACTCGAGTTCTTTCATCTGCTTTGAAGG-3'。sh RNA模 板中的loop結(jié) 構(gòu)選用CTCGAG,sh RNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正向引物模板5'端添加了CCGG,與AgeⅠ酶切后形成的粘端互補(bǔ);反向引物模板5'端添加了AATT,與EcoRⅠ酶切后形成的粘端互補(bǔ)。采用GV248干擾載體構(gòu)建GRHL2-sh RNA表達(dá)載體,使用AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切GV248載體以使其線性化,之后利用T4連接酶將其與退火的雙鏈oligo于16℃連接過(guò)夜,之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α,挑取重組陽(yáng)性克隆行PCR及測(cè)序鑒定,然后將GV248重組載體、p GC-LV載體、p Helper 1.0載體、p Helper 2.0載體制備慢病毒包裝系統(tǒng),轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝成GRHL2沉默慢病毒,其對(duì)應(yīng)的空載慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染 將A549細(xì)胞分為3個(gè)組,實(shí)驗(yàn)組:GRHL2沉默慢病毒感染的A549細(xì)胞系;陰性對(duì)照組:空載慢病毒感染的A549細(xì)胞系;空白對(duì)照組:不給予任何處理的A549細(xì)胞系。在感染前24 h,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)過(guò)夜,待細(xì)胞的匯合度為30%～40%后,根據(jù)A549細(xì)胞的復(fù)感染指數(shù),在實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組中分別加入相應(yīng)的病毒上清液,同時(shí)加入終濃度為8 mg/L的凝聚胺以增加感染效率,感染24 h后更換為含1 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每24 h采用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光的強(qiáng)度和細(xì)胞存活狀態(tài),在熒光顯微鏡下檢測(cè)感染率,收取感染效率在80%以上的細(xì)胞作為目的細(xì)胞。

1.2.3 GRHL2表達(dá)的檢測(cè)

1.2.3.1 q RT-PCR檢 測(cè)GRHL2 mRNA表 達(dá) 取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞各1×106個(gè),按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,然后以c DNA為模板,采用qRT-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞GRHL2 m RNA的表達(dá)水平,以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件:95℃30 s;95℃10 s,60℃30 s,40個(gè)循環(huán)。GRHL2正向引物5'-AGCCTGAGCACTGTGGAGTT-3',GRHL2反向引物5'-GCTGCTGGCCTGAATGTAAT-3';β-actin正 向 引 物5'-CCTGGCACC-CAGCACAAT-3',β-actin反向引物5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。相對(duì)基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt分析法進(jìn)行分析,ΔCt=目的基因Ct值-β-actin Ct值;ΔΔCt=各樣品ΔCt-空白對(duì)照組ΔCt平均值。重復(fù)3次,取均值。

1.2.3.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)GRHL2蛋白質(zhì)的表達(dá) 收取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞各1×106個(gè),提取總蛋白。通過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白定量,然后經(jīng)常規(guī)10%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜和蛋白印跡反應(yīng)。GRHL2抗 體(1∶2 000)和 β-actin抗 體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h后用ECL顯色液曝光。重復(fù)3次,取均值。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,完全培養(yǎng)基重懸制備成細(xì)胞懸液,每孔100μl細(xì)胞懸液接種于96孔板上(細(xì)胞計(jì)數(shù):2×103/孔),每組3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～6 d,每天固定時(shí)間于酶標(biāo)儀下測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。測(cè)量前,將10μl CCK-8試劑加入待測(cè)孔,輕輕振搖96孔板后,放入5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h。酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。重復(fù)3次,取均值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化收集3組細(xì)胞,用冷PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次,離心半徑7 cm,2 000 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)基后收集5×105個(gè)細(xì)胞,加入500μl的連接緩沖液用于重懸收集的細(xì)胞。先后加入5μl Annexin V-APC和5μl PI染液后混勻。室溫下避光反應(yīng)15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。重復(fù)3次,取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,多組間比較用單因素方差分析,2組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒穩(wěn)定細(xì)胞株熒光顯微鏡下觀察結(jié)果各組細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞中GFP表達(dá)比例達(dá)80%以上,而空白對(duì)照組細(xì)胞中無(wú)GFP表達(dá)。

2.2 qRT-PCR、Western blot驗(yàn)證GRHL2在人肺腺癌A549細(xì)胞中沉默表達(dá)成功 各組細(xì)胞中GRHL2的m RNA表達(dá)水平如圖2所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)組中A549細(xì)胞的GRHL2 mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著下降(t=0.48,P＜0.05),而陰性對(duì)照組中A549細(xì)胞的GRHL2 m RNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(t=0.81,P＞0.05)。通過(guò)Western blot分析,同樣發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中GRHL2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平相比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均明顯下降(F=42.57,P＜0.05),而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組GRHL2蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.24,P＞0.05),見(jiàn)圖3。

圖1 各組細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況 ×200

圖2 各組A549細(xì)胞中GRHL2 m RNA的表達(dá)變化

2.3 GRHL2沉默抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖 采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況,繪制細(xì)胞增殖曲線圖(圖4)。結(jié)果顯示,A549細(xì)胞培養(yǎng)2 d,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度下降,但3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.13,P＞0.05),而在3～6 d,實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制(F=65.64,P＜0.05)。在3～6 d,陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞增殖速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.75,P＞0.05)。

圖3 各組A549細(xì)胞中GRHL2蛋白的表達(dá)變化

2.4 GRHL2沉默促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞儀對(duì)3組細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.76,P＜0.05),見(jiàn)圖5、6。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低,2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.08,P＞0.05)。

圖4 GRHL2沉默對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響

圖6 GRHL2沉默對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡情況 A:空白對(duì)照組;B:陰性對(duì)照組;C:實(shí)驗(yàn)組

肺癌早期癥狀不典型,大部分在確診時(shí)已處于中晚期,失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì),化療及放療是目前肺癌治療的主要方法,但已達(dá)瓶頸期,無(wú)突破性進(jìn)展。基因靶向治療為肺癌治療提供了新的方式。慢病毒是一種功能強(qiáng)大逆轉(zhuǎn)錄病毒,它可以將目的基因安全有效的植入到宿主細(xì)胞DNA中,可感染或轉(zhuǎn)染幾乎所有的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞,并在其中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)[7],起到了很好的基因治療效果。因此,在各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中,它成為了基因遞送最有效的載體之一,在腫瘤的分子靶向研究方面獲得了廣泛的應(yīng)用[8-10],為腫瘤的基因靶向治療提供了更廣闊的前景。

GRHL是哺乳動(dòng)物所具有的一種似果蠅粒狀頭樣轉(zhuǎn)錄因子,目前發(fā)現(xiàn),GRHL家族包括GRHL1/2/3 3種亞型,它們表現(xiàn)出序列和生物化學(xué)方面的相似性[11-12]。其中GRHL2參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。GRHL2通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因,如端 粒 酶、P63、Wnt、TGF-β、mir200、ZEB1、OVOL2、p300等,在細(xì)胞增殖和分化中起到獨(dú)特作用[13]。GRHL2沉默表達(dá)顯著抑制體外細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤的發(fā)生,其分子機(jī)制涉及對(duì)ZEB1和E-cadherin的調(diào)控作用[14]。目前GRHL2與肺癌的研究較少,有文獻(xiàn)報(bào)道GRHL2通過(guò)調(diào)節(jié)RhoG轉(zhuǎn)錄活性抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移[15]。

本研究將GRHL2沉默慢病毒感染肺腺癌A549細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況,表明GRHL2沉默慢病毒及其空載慢病毒成功感染A549細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá),并經(jīng)q RT-PCR和Western blot驗(yàn)證,對(duì)照組慢病毒感染A549細(xì)胞對(duì)GRHL2表達(dá)無(wú)明顯影響,建立了GRHL2沉默慢病毒A549穩(wěn)定細(xì)胞株。同時(shí),本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)照組慢病毒感染對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡無(wú)明顯影響,而GRHL2沉默抑制A549細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡。Paltoglou等[16]研究表明,GRHL2促進(jìn)前列腺癌的生長(zhǎng),敲低GRHL2抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。Kang等[17]發(fā)現(xiàn)敲除GRHL2基因使h TERT啟動(dòng)子活性顯著降低,減少端粒酶活性和抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖能力。Faddaoui等[18]研究表明,抑制GRHL2基因的表達(dá),抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。但是,Xiang等[19]研究表明,GRHL2明顯降低c-Myc和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平,抑制胃癌細(xì)胞增殖。Werner等[20]研究表明,GRHL2在乳腺癌中具有雙重調(diào)節(jié)作用,既可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖,又可以抑制EMT相關(guān)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果與前三項(xiàng)研究[16-18]一致,而與Werner等[20]相悖。產(chǎn)生這一差異的原因可能是GRHL2在不同腫瘤細(xì)胞中,甚至在同一腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用,其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn),慢病毒介導(dǎo)的GRHL2沉默表達(dá)抑制了肺癌A549細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,由此可見(jiàn)GRHL2對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,但其作用機(jī)制尚不明確。筆者將進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GRHL2對(duì)肺癌的影響,以期為肺癌的治療提供新的分子靶標(biāo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突