張繼華，董凱峰，蘇靜，李丹，田君海

大量實(shí)驗(yàn)顯示，上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在誘導(dǎo)惡性腫瘤局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著不可替代的作用。這一過(guò)程是由多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑觸發(fā)和調(diào)控的，這些信號(hào)途徑能夠?qū)?xì)胞外的刺激產(chǎn)生應(yīng)答而激活。在這些傳導(dǎo)途徑中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)途徑被認(rèn)為是最重要的途徑之一[1-2]。以往研究表明，SIX1同TGF-β相互作用能夠促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3]，推測(cè)SIX1及TGF-β在喉鱗癌細(xì)胞中表達(dá)的變化，會(huì)進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程，進(jìn)而影響喉癌的轉(zhuǎn)移，但它們之間的相互作用機(jī)制及對(duì)喉癌細(xì)胞EMT的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)喉鱗癌細(xì)胞中SIX1、TGF-β及上皮標(biāo)志物E-cadherin的mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)， 旨在探討人喉鱗癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中SIX1 和TGF-β的相互作用及機(jī)制，為臨床診治提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)試劑試藥：SIX1免疫組化用多克隆抗體(工作濃度為1∶75)、TGF-β免疫組化用多克隆抗體(工作濃度為1∶55)由武漢博士德公司提供， E-cadherin免疫組化用多克隆抗體(工作濃度為1∶50)由北京奧維亞生物技術(shù)有限公司提供，免疫組化用S-P染色試劑盒、DAB顯色用試劑由北京中杉金橋公司提供。轉(zhuǎn)染用SIX1和TGF-β試劑盒由美國(guó)Invitrogen公司提供。胎牛血清(購(gòu)自杭州四季青生物材料研究所)置于-20℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?胰蛋白酶(購(gòu)自GIBCO公司，北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司分裝)。用D-hank’s液配成0.25%溶液，無(wú)菌條件下濾過(guò)孔徑 0.22 μm的混合纖維素微孔濾膜，無(wú)菌分裝后，-20℃冰箱低溫保存?zhèn)溆?。硫酸慶大霉素注射液(輔仁藥業(yè)有限公司)。 (2)儀器設(shè)備： MCO175型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋產(chǎn)品)。CX-PC-2型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng):收集2016年1月—2018年1月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉科行喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)患者21例，均留存切除組織，置于4℃的0.9%氯化鈉注射液中無(wú)菌保存。部分組織塊盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)，進(jìn)行處理并原代細(xì)胞培養(yǎng)，修剪留取新鮮、正常腫瘤組織，慶大霉素殺菌處理15 min，0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，將組織塊剪碎(初步使組織塊分離成單細(xì)胞)，慶大霉素液沖洗2次，0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，加入Ⅰ型膠原酶消化1 h，每間隔10 min進(jìn)行一次吹打混合，促進(jìn)喉癌組織塊分解成單個(gè)腫瘤細(xì)胞。消化結(jié)束后，生理鹽水沖洗細(xì)胞混合液2次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，內(nèi)含20%胎牛血清，將細(xì)胞懸濁液接種于6孔滅菌細(xì)胞培養(yǎng)板，上述接種的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，培養(yǎng)孔內(nèi)加入消化用胰蛋白酶，利用雜質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞為主)與喉鱗癌腫瘤細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶消化作用不同，而出現(xiàn)不同細(xì)胞脫離培養(yǎng)板底壁時(shí)間差異，去除雜質(zhì)細(xì)胞。反復(fù)進(jìn)行上述純化，直至得到純化的腫瘤細(xì)胞。待其穩(wěn)定傳代后，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定并確認(rèn)為鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(由2名高年資病理科醫(yī)生共同鑒定)，擴(kuò)增細(xì)胞，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組: 待細(xì)胞生化穩(wěn)定后，制作SIX1 siRNA、TGF-β siRNA和SIX1+TGF-β siRNA，siRNA轉(zhuǎn)染至原代人喉癌細(xì)胞，沉默細(xì)胞內(nèi)的SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β基因表達(dá)。具體步驟如下，接種原代人喉鱗癌細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔腫瘤細(xì)胞量約為3×105個(gè)，每孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)液約2 ml，放于培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，單層細(xì)胞量約60%匯合時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。A溶液配制(用于轉(zhuǎn)染的純DNA 2 μg加入不含血清培養(yǎng)液中，最終體積約100 μl)，B溶液(LipofectAMINE 100 μl，加入不含血清培養(yǎng)液中，最終體積120 μl)，混合A和B 2種溶液，輕搖勻，室溫下放置30 min。用細(xì)胞培養(yǎng)液2 ml輕洗滌腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)液(不含血清)0.8 ml，加入上述復(fù)合物，輕輕搖動(dòng)混勻混合液，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱，常規(guī)孵育24 h。用完全細(xì)胞培養(yǎng)基替換孔內(nèi)轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h， PCR法對(duì)SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β表達(dá)檢測(cè)，檢測(cè)確定轉(zhuǎn)染成功后分組：未轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)組、SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達(dá)：消化原代人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，使其濃度為1×105個(gè)/ml， 取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，板內(nèi)置已滅菌玻璃片，每組設(shè)6孔，向孔內(nèi)滅菌玻璃片上接種腫瘤細(xì)胞，每孔接種上述細(xì)胞懸液1滴。細(xì)胞移至細(xì)胞培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，待玻璃片上>80%細(xì)胞已經(jīng)貼壁，向培養(yǎng)板內(nèi)加DMEM培養(yǎng)液每孔約1 ml。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)板內(nèi)腫瘤細(xì)胞已達(dá)80%～90%匯合，取出培養(yǎng)板，PBS溶液沖洗1次，甲醛溶液固定10 min，PBS溶液沖洗2次，每次5 min。留取玻璃片上爬片細(xì)胞，參照免疫組化試劑說(shuō)明，進(jìn)行爬片細(xì)胞免疫熒光染色，蓋玻片封存，鏡檢。

結(jié)果判斷。采用半定量雙評(píng)分法，倒置熒光顯微鏡高倍鏡視野下根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度做綜合判定。高倍鏡下視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞比例：陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%，記0 分；陽(yáng)性細(xì)胞比例25%～50%，記1 分；陽(yáng)性細(xì)胞比例51%～75%，記2 分；陽(yáng)性細(xì)胞比例>75%，記3分。表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，未見(jiàn)熒光或僅見(jiàn)極弱熒光， 記0 分；熒光微弱但明顯可見(jiàn)，記1 分；熒光可見(jiàn)且光色明亮，記2 分；熒光可見(jiàn)且光色閃亮， 記3 分。2種方法所得評(píng)分相加為總分，得分0～1分為目的蛋白陰性(-)； 2分為目的蛋白弱陽(yáng)性(+)； 3～4分為目的蛋白陽(yáng)性(++)， 5～6分為目的蛋白強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3.2 Western-blot法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)SIX1、TGF-β、E-cadherin蛋白表達(dá)：參照試劑說(shuō)明書，提取樣本蛋白，制備Western-blot檢測(cè)樣品，檢測(cè)各組樣品蛋白濃度，常規(guī)上樣，配制選用12%分離膠及4%濃縮膠，每組樣品上樣量65 μg，同時(shí)設(shè)置Marker預(yù)染蛋白，100 V電泳約85 min，轉(zhuǎn)膜30 V，0.9 mA過(guò)夜。洗膜，定影后進(jìn)行圖像分析。

1.3.3 RT-PCR法測(cè)定各組腫瘤細(xì)胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA：Trizol法提取樣本腫瘤細(xì)胞總RNA，檢測(cè)各組樣本細(xì)胞濃度，確定樣本細(xì)胞RNA完整，cDNA反轉(zhuǎn)錄合成，取轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。GAPDH引物序列上游 5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3' ,下游 5'-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3';SIX1引物序列上游5′-CCACTAGAAGAGGAATT-3′，下游5′-CACGCCGGAGCCAAACT-3′，產(chǎn)物大小254 bp，退火溫度56.3℃； TGF-β引物序列上游 5′- CTGTAATTCTGCTGTAATA-3′，下游 5′-GGCTTAGTATTCTGGGAAA-3′，產(chǎn)物大小287 bp，退火溫度54.2℃；E-cadherin引物序列上游5'-AGGCCAAGCAGCAGTACATT-3' ，下游5'-ATTCACATCCAGCACATCCA-3，產(chǎn)物大小為288 bp，退火溫度為56.6℃。反應(yīng)條件如下，94℃變性1 min，57℃復(fù)性1 min，75℃延伸1 min，共設(shè)計(jì)32個(gè)循環(huán)，最后設(shè)計(jì)75℃延伸10 min。以GAPDH的熒光表達(dá)量度作為檢測(cè)基因表達(dá)參照量。

2 結(jié) 果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組人喉鱗癌細(xì)胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達(dá)比較 與未轉(zhuǎn)染組比較，空轉(zhuǎn)組細(xì)胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，TGF-β蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；TGF-β轉(zhuǎn)染組TGF-β蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，SIX1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白及TGF-β蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組E-cadherin 蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=6.846/0.006)。TGF-β轉(zhuǎn)染組、SIX1轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組比較，E-cadherin蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

表1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較分)

圖1 各組喉鱗癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)情況(免疫熒光染色，×100)

2.2 Western-blot法檢測(cè)各組人喉鱗癌細(xì)胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達(dá)比較 與未轉(zhuǎn)染組比較，空轉(zhuǎn)組細(xì)胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，TGF-β蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；TGF-β轉(zhuǎn)染組TGF-β蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，SIX1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白及TGF-β蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組E-cadherin 蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=13.396/0.000)，TGF-β轉(zhuǎn)染組、SIX1轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組比較，E-cadherin蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 RT-PCR法測(cè)定各組人喉鱗癌細(xì)胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達(dá)水平比較 與未轉(zhuǎn)染組比較，空轉(zhuǎn)組細(xì)胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組SIX1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，TGF-β mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；TGF-β轉(zhuǎn)染組TGF-β mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，SIX1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組SIX1 mRNA及TGF-β mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組E-cadherin mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=9.673/0.000)，TGF-β轉(zhuǎn)染組、SIX1轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組比較，E-cadherin mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2、表3。

注： A.空轉(zhuǎn)組；B.未轉(zhuǎn)染組；C.SIX1轉(zhuǎn)染組；D.TGF-β轉(zhuǎn)染組； E.SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組

圖2 E-cadherin mRNA 在各組人喉鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

3 討 論

上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指腫瘤上皮細(xì)胞在一定的環(huán)境及相應(yīng)轉(zhuǎn)化因子等因素共同影響下逐步轉(zhuǎn)變成充質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，EMT是惡性腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)變的過(guò)程之一，與惡性腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。EMT轉(zhuǎn)化的過(guò)程主要表現(xiàn)為原腫瘤上皮細(xì)胞極性逐漸消失，上皮細(xì)胞與周圍其他細(xì)胞的接觸相應(yīng)減少，細(xì)胞間的連接包括黏附連接及緊密連接減少，使得細(xì)胞脫離的機(jī)會(huì)增加，易于發(fā)生局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處遷移；EMT的發(fā)生會(huì)出現(xiàn)原有上皮細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，其上皮表型如E- eadherin、角蛋白絲等消失，間質(zhì)表型纖維連接蛋白、N-鈣黏素等逐漸形成。其中代表細(xì)胞間黏附力的E-cadherin表達(dá)下降是EMT的主要表現(xiàn)，也被視為EMT轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[4]。實(shí)驗(yàn)研究表明，EMT與腫瘤細(xì)胞向局部浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移的過(guò)程密切相關(guān)，EMT可誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移，如卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌及惡性黑色素瘤等[5-8]。因此，EMT被認(rèn)為是多種上皮來(lái)源腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標(biāo)志。

表2 Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較

表3 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達(dá)水平比較

上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程是由多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路觸發(fā)和調(diào)控的，在這些信號(hào)傳導(dǎo)通路中，TGF-β被認(rèn)為是最重要的途徑之一。TGF-β能夠通過(guò)MAPK (mitogen-activated protein kinases)通路、SMAD通路及Wnt通路等途徑對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)，在大腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中均存在TGF-β的高表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[9-11]。以往的研究證實(shí)，TGF-β能夠被細(xì)胞中的多種活性因子激活，并與這些因子共同作用，激活及影響細(xì)胞內(nèi)多種傳導(dǎo)通路，但腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)能否增強(qiáng)TGF-β途徑在誘導(dǎo)人喉鱗癌EMT過(guò)程中的作用尚不清楚。

SIX1(sine oculis homeobox homolog 1)是一種與細(xì)胞成熟相關(guān)的細(xì)胞因子，在發(fā)育成熟的細(xì)胞內(nèi)很少表達(dá)，然而最近研究表明，SIX1在多種惡性腫瘤組織中卻呈現(xiàn)出高表達(dá)，SIX1能夠影響Cyclin A1、Cyclin D1及Ezrin 等多種下游編碼基因的表達(dá)。SIX1在卵巢癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[12-14]。最近研究證明，SIX1 能夠與TGF-β共同作用，并通過(guò)SMAD2/3途徑調(diào)節(jié)VEGF等多種基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移功能，基于以上研究結(jié)果，本研究探討SIX1與TGF-β是否在人喉鱗癌EMT的過(guò)程中起著促進(jìn)作用。

Sun等[15]的研究結(jié)果顯示，SIX1能夠同 TGF-β共同作用促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步提高卵巢癌細(xì)胞局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。本結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，喉癌細(xì)胞內(nèi)SIX1表達(dá)降低的同時(shí)出現(xiàn)了E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)，同樣，TGF-β表達(dá)降低的同時(shí)也出現(xiàn)了喉癌細(xì)胞E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明SIX1及TGF-β均參與了人喉鱗癌細(xì)胞EMT的過(guò)程，SIX1和/或TGF-β表達(dá)降低均能抑制人喉鱗癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，抑制TGF-β表達(dá)、抑制SIX1表達(dá)同抑制SIX1+TGF-β表達(dá)均能導(dǎo)致人喉鱗癌細(xì)胞E-cadherin mRNA及其蛋白表達(dá)的上調(diào)，且3組間E-cadherin mRNA及其蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在人喉鱗癌細(xì)胞EMT的過(guò)程中TGF-β及SIX1并不能單獨(dú)發(fā)揮作用，而需要TGF-β和SIX1共同作用。SIX1和TGF-β共同誘導(dǎo)人喉鱗癌細(xì)胞EMT的過(guò)程是通過(guò)TGF-β及SIX1共同作用途徑實(shí)現(xiàn)的。推測(cè)SIX1在人喉鱗癌細(xì)胞中表達(dá)升高能夠增強(qiáng)TGF-β對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，進(jìn)而通過(guò)TGF-β途徑促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。與此同時(shí)，TGF-β促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程需要SIX1的存在，但其具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上，SIX1 、TGF-β共同作用可能是人喉鱗癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，SIX1和TGF-β是人喉鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的重要標(biāo)志，有望成為臨床治療人喉鱗癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張繼華：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫，論文修改；董凱峰：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理；蘇靜：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；李丹：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文撰寫；田君海：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核