徐少華，黃 婷

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518005）

全氯霉素是一種抑制性的廣譜抗生素，可以抑制骨髓細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，對(duì)人類和動(dòng)物的骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞具有毒性作用，不僅可引起細(xì)胞減少性貧血、血小板減少和再生障礙性貧血，還可導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、二重感染等[1-2]。長(zhǎng)期微量攝入氯霉素不僅使沙門氏菌、大腸桿菌等產(chǎn)生耐藥性，還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體正常菌群失調(diào)，使人們易患各種疾病。隨著人們生活水平的提高，動(dòng)物性食品的食用安全越來越受關(guān)注。世界上很多國(guó)家都對(duì)其作出了規(guī)定，我國(guó)在農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中也明確地將氯霉素列為禁用藥物。目前監(jiān)測(cè)氯霉素類藥物殘留的方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法[3-6]等?，F(xiàn)有的氯霉素類藥物檢測(cè)方法前處理往往比較復(fù)雜，消耗試劑較多，檢測(cè)周期長(zhǎng)成本高。本研究建立了一種針對(duì)雞肉中氯霉素的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法。本方法減少試劑用量、改善提取液凈化步驟，簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高，可以檢測(cè)市場(chǎng)上雞肉中氯霉素的含量，對(duì)質(zhì)量檢測(cè)方法的進(jìn)步和市民的身體健康有重大意義。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與儀器

液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）（美國(guó)Agilent LC 1290/Sciex 5500）；電子天平（感量0.01 g、感量0.000 1 g）（梅特勒電子天平）；高速離心機(jī)（美國(guó)sigma公司）；固相萃取裝置；超聲波清洗儀；可控溫氮吹濃縮儀；渦旋振蕩器。

1.2 試驗(yàn)材料

水符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氯霉素（氯霉素、氯霉素-D5）純度≥99.6%，購自德國(guó)DR公司；試劑：甲醇（CH3OH）、乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH），色譜純：均購自德國(guó)默克公司；溶劑：乙腈水溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸；甲醇水溶液：10%甲醇水+0.1%甲酸；濾膜：水相，0.22 μm（上海安譜）；PRIME HLB（6 cc 200 mg）固相萃取柱（美國(guó)Waters）。

1.3 試劑配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均用甲醇配制成1.00 mg·mL-1，在-18℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.00 μg·mL-1）：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋成1.00 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，在-18℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為3個(gè)月。

內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng·mL-1）：準(zhǔn)確吸取氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)中間溶液1.0 mL，用甲醇稀釋并定容至10 mL，在4℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)藥物的靈敏度和儀器線性范圍，用乙腈水溶液配成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 儀器條件

2.1.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）（美國(guó)waters公司）；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5.0 μL；

流動(dòng)相及梯度洗脫程序見表1。

表1 氯霉素藥物流動(dòng)相梯度洗脫

2.1.2 質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4 500 V。

離子源溫度（TEM）：550℃；氣簾氣CUR：35 psi；碰撞氣壓力CAD：8 psi；噴霧氣GS1：55 psi；輔助加熱氣GS2：55 psi；藥物保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)及去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）見表2。

表2 氯霉素藥物及氯霉素內(nèi)標(biāo)的CAS號(hào)、保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)及去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）

2.2 前處理

2.2.1 提取

稱取試樣2 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管內(nèi)，加入100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液（1.3.3）40 μL，加乙腈水溶液（1.2.6）10 mL，震蕩搖勻30 s，超聲波清洗儀超聲5 min，高速離心機(jī)6 000 r·min-1離心6 min。

2.2.2 凈化

于上述離心后提取液中移取3.5 mL上清液，直接過6 cc規(guī)格PRIME HLB固相萃取柱（6 cc，200 mg），保持速度1 s·滴-1。用玻璃小管收集全部流出液, 準(zhǔn)確移出2.5 mL至15 mL帶刻度小管內(nèi)。流出液在40℃水浴下氮?dú)獯?.5 mL。殘留液用甲醇水溶液（1.2.7）定容至1.00 mL，過0.22 μm水相濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

精密量取氯霉素藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用相應(yīng)的空白樣品基質(zhì)提取液制備混合標(biāo)準(zhǔn)濃度系列：氯霉素濃度為 0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，并根據(jù)試劑濃度和響應(yīng)的峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2.4 試驗(yàn)靈敏度、回收率和精密度的測(cè)試

本試驗(yàn)以雞肉樣品為基質(zhì)，添加濃度為0.2 μg·kg-1，按照上述方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，平行樣品n=6，根據(jù)各樣品檢測(cè)值，計(jì)算出方法檢出限（MDL），計(jì)算公式見式1。

其中k為置信因子取3。本試驗(yàn)通過陰性樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)加標(biāo)樣品檢測(cè)值與加標(biāo)濃度比值計(jì)算實(shí)驗(yàn)回收率。再通過平行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出試驗(yàn)的精密度，用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)誤差和穩(wěn)定性。

2.5 結(jié)果計(jì)算

本試驗(yàn)以內(nèi)標(biāo)方法單點(diǎn)校準(zhǔn)進(jìn)行定量測(cè)定，計(jì)算出試樣中的氯霉素藥物的含量，計(jì)算公式見式2。

式中，X-試樣中待測(cè)組分殘留量（μg·kg-1）；CS-標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度（ng·mL-1）；V1-試樣提取體積（mL）；V2-試樣移取體積（mL）；V3-試樣定容體積（mL）；m-樣品稱樣量（g）；A-樣液中待測(cè)目標(biāo)物的峰面積；AS-標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積；Asi-標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai-樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 高效液相條件確定

為尋找分離度好，靈敏度高，峰形尖銳的液相條件，參考相關(guān)文獻(xiàn)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，選用ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）色譜柱，柱溫為40℃，采用乙腈和水作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣流速為0.30 ng·mL-1時(shí)，氯霉素響應(yīng)強(qiáng)度1.3×103，背景基線非常低，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，可有效進(jìn)行氯霉素藥物的定性定量檢測(cè)。

圖1 陰性樣品添加0.1 ng·mL-1氯霉素離子通道色譜圖

3.2 前處理方法的確定

由于雞肉呈現(xiàn)纖維狀，所以需要用本方法先將雞肉做粉碎處理，選用乙腈水溶液作為提取液，超聲離心后可以充分提取氯霉素藥物，其中試劑也起到了稀釋的作用，有利于降低其他成分對(duì)于儀器檢測(cè)的干擾，并且提高儀器檢測(cè)的靈敏度。

3.3 線性范圍和方法檢出限

按照方法條件設(shè)置參數(shù)，配置一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液（0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1），待儀器穩(wěn)定之后，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為r=0.999。

以雞肉樣品為基質(zhì)，添加濃度為0.2 μg·kg-1，按照上述方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，平行樣品n=6，根據(jù)各樣品檢測(cè)值（0.18、0.20、0.20、0.16、0.20、0.18 μg·kg-1，計(jì)算出平均值X（0.187 μg·kg-1）及標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb（0.0164），當(dāng)被分析物的回收率在70%～120%時(shí)，可計(jì)算方法檢出限為0.05 μg·kg-1。

圖2 陰性樣品添加0.1 ng·mL-1氯霉素-D5離子通道色譜圖

3.4 方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

以雞肉樣品為基質(zhì)，進(jìn)行六組平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為0.2、1.0、2.0 μg·kg-1。將加標(biāo)樣品和空白樣品按前述方法進(jìn)行處理，上機(jī)測(cè)試，加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍分別為80%～100%、88%～100%、93～100%。結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)精密度和回收率

4討論

本試驗(yàn)討論建立雞肉中氯霉素藥物高相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法。該方法通過乙腈水溶液提取，離心氮吹的處理步驟。最終建立的方法檢出限達(dá)到 0.05 μg·kg-1，線性范圍為 0.1～100 μg·L-1，其相關(guān)系數(shù)r=0.999。雞肉樣品在0.2、1.0、2.0μg·kg-13個(gè)水平添加回收實(shí)驗(yàn)條件下，回收率為80%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.67%～8.81%。該方法具有分析過程簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能滿足雞肉中常見氯霉素藥物快速定性定量檢測(cè)的要求。