徐曉蘭 陳體強(qiáng) 蘭進(jìn) 陳向東 朱風(fēng)麗 陳虎 石林春 陳士林

摘要?目的：基于赤芝全基因組序列開發(fā)SSR標(biāo)記，研究其種質(zhì)資源遺傳多樣性，為赤芝種質(zhì)資源品種鑒定和分子育種提供理論基礎(chǔ)。方法：利用60對(duì)SSR引物，對(duì)26份不同來(lái)源的赤芝菌株進(jìn)行擴(kuò)增以篩選出具有多態(tài)性的位點(diǎn);采用毛細(xì)管電泳對(duì)其進(jìn)行基因分型，并分析菌株間的遺傳多樣性。結(jié)果：60對(duì)引物中，篩選出24個(gè)有多態(tài)性條帶的SSR位點(diǎn)。共擴(kuò)增出269個(gè)多態(tài)性條帶，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)增出11.20個(gè)多態(tài)性條帶;檢測(cè)出150個(gè)等位基因，平均檢測(cè)出6.23種基因型;各引物的多態(tài)信息含量（PIC）為0.57～0.91，平均為0.81;遺傳一致性和遺傳距離變異范圍分別為0.28～0.95和0.06～0.73;聚類分析結(jié)果分析可以很好的反映出各個(gè)菌株間的親緣關(guān)系，在遺傳距離系數(shù)0.17處可分為4大類，部分來(lái)自同一地區(qū)的菌株材料分散于各個(gè)分支，未體現(xiàn)明顯地域性，說(shuō)明菌株的遺傳背景復(fù)雜，多態(tài)性高。結(jié)論：篩選出的24個(gè)赤芝SSR位點(diǎn)，可以用于赤芝菌株資源遺傳多樣性分析，為赤芝優(yōu)良品種的引種及選育提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?赤芝;基因組;SSR標(biāo)記;多態(tài)性;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;聚類分析;育種

SSR Loci Selection Based on Ganoderma lucidum Genome and Genetic Diversity Analysis

XU Xiaolan1， CHEN Tiqiang2， LAN Jin3， CHEN XiangDong3， ZHU Fengli1， CHEN Hu1， SHI LinChun3， CHEN Shilin4

（ 1 College of Bee Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2 Institute of Edible and Medicinal Fungi， Fujian Academy of Agriculture Science， Fuzhou 350014， China; 3 Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College， Beijing 100193， China; 4 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract?Objective：To study genetic diversity of its germplasm resources and to provide theoretical bases for the resource variety identification and molecular breeding of G.lucidum.based on SSR markers of the whole genome of Ganoderma lucidum.Methods：A total of 26 G.lucidum strains from different regions were amplified to screen out polymorphic sites using 60 pairs of SSR primers.The genotyping was carried out by capillary electrophoresis and the genetic diversity among the strains was analyzed.Results：Among 60 primer pairs， 24 SSR loci with polymorphic bands were selected.A total of 269 polymorphic bands were amplified， with an average of 11.20 polymorphic bands per SSR locus; a total of 150 alleles （Ne） were detected with an average of 6.23 type of gens.The polymorphism information content （PIC） of the primers were ranged from 0.57 to 0.91， and the average was 0.81.Genetic identity and genetic distance variation range were 0.28-0.95 and 0.06-0.73， respectively.The results of cluster analysis can well reflect the genetic relationship between various strains and can be divided into 4 subgroups with genetic distance coefficient of 0.17.The strains materials from the same region were scattered in various branches， which did not show obvious regional characteristics， indicating that the genetic background of G.lucidum strains was complex and highly polymorphic.Conclusion：The 24 selected SSR loci can be used to analyze the genetic diversity of the G.lucidum strains， which provide the theoretical basis for the introduction and breeding of the best varieties of G.lucidum.

Keywords?Ganoderma lucidum; Genome; SSR maker; Polymorphism; Germplasm resources; Genetic diversity; Clustering analysis; Breeding

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.004

赤芝（Ganoderma lucidum）是我國(guó)著名的藥用真菌之一，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、保肝解毒、抗放射、抗病毒和抑菌等作用[1-3]。我國(guó)赤芝種質(zhì)資源相當(dāng)豐富，民間用于栽培和工業(yè)發(fā)酵的菌株相當(dāng)多。中國(guó)從事靈芝研究的高校、各級(jí)科研院所及公司企業(yè)超上百家，各自擁有一定數(shù)量的靈芝種質(zhì)資源，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)現(xiàn)有數(shù)百種。近年來(lái)，四川、山東、廣西、安徽、福建和江西等地都在不斷地?cái)U(kuò)大赤芝栽培規(guī)模。栽培規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，使得地區(qū)之間相互引種，而導(dǎo)致菌種的名稱混雜。目前靈芝菌種的命名多由各菌種保藏中心、科研院所或者是菌種供應(yīng)企業(yè)提供，缺乏統(tǒng)一的規(guī)范，在引種過(guò)程中還會(huì)發(fā)生被更換的現(xiàn)象，使得菌種間的親緣關(guān)系難以確定，因此菌種市場(chǎng)較為混亂，影響了靈芝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

除了傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定法和拮抗法，分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展也為赤芝菌株的分類和遺傳多樣性分析提供了新的技術(shù)和方法，包括RAPD[4-5]、ISSR[6-7]、SRAP[8-9]等。近年來(lái)，由于SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、具有多等位基因，且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛的被用于農(nóng)作物的品種鑒定、種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性的分析中[10-12]。2012年，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳士林課題組完成了赤芝G260125-1全基因組的測(cè)序工作。赤芝全基因組的闡釋為靈芝功能基因的研究提供了基礎(chǔ)，也為SSR的挖掘提供了數(shù)據(jù)[13-14]。在赤芝中，總共發(fā)現(xiàn)了2 674個(gè)SSR位點(diǎn)，其中單堿基重復(fù)最為豐富[15]。盡管前期研究已對(duì)靈芝SSR位點(diǎn)相關(guān)信息進(jìn)行了分析，但關(guān)于SSR在靈芝各功能基因中的標(biāo)記以及SSR引物還未被開發(fā)。

本研究選用了來(lái)自不同地區(qū)的26個(gè)赤芝菌株作為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)赤芝全基因組序列篩選SSR引物，開展遺傳多樣性研究，為促進(jìn)赤芝種質(zhì)資源保護(hù)和品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?菌株材料

用于本研究的26個(gè)赤芝菌株來(lái)自北京、山東、浙江、四川、安徽、湖北、江西和福建等地，詳細(xì)情況見(jiàn)表1。

1.2?赤芝DNA提取

赤芝菌株保存在斜面試管，轉(zhuǎn)接平面培養(yǎng)基上，28 ℃活化后轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，收集菌絲。使用DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，中國(guó)，批號(hào)：Lot#S7412）提取基因組總DNA。

1.3?SSR-PCR反應(yīng)

根據(jù)課題組前期基于赤芝全基因組序列的SSR分析結(jié)果，設(shè)計(jì)60對(duì)引物，篩選出具有多態(tài)性的24對(duì)引物。見(jiàn)表2。

SSR-PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板總DNA為20～50 ng，正向引物為1 μL（濃度10 μmol/L），反向引物1.0 μL（濃度10 μmol/L），2×EasyTaq SuperMix 12.5 μL（北京全式金生物，中國(guó)，批號(hào)：Lot#20316），剩余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s、55 ℃～65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行微衛(wèi)星分析。

1.4?數(shù)據(jù)分析

利用GeneMapper軟件分析原始數(shù)據(jù)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。利用Microsatellite Toolkit軟件計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）。利用Popgene32 V1.32軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon信息指數(shù)（I）、Nei′s遺傳距離和遺傳一致性。根據(jù)Nei′s遺傳距離，利用Mega 6.0軟件UPGMA法對(duì)不同靈芝菌株間的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析。

2?結(jié)果

2.1?赤芝SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

本研究共篩選得到具有多態(tài)性的24對(duì)引物，對(duì)26份赤芝基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)得到269個(gè)SSR條帶。見(jiàn)表3。每對(duì)引物5～19條，其中引物1和19擴(kuò)增的條帶最多為19條，引物18擴(kuò)增的條帶最少為5條，平均條帶數(shù)為11.20。22對(duì)引物PIC（多態(tài)性信息量）的變化范圍是0.57～0.91，平均值為0.81。其中，PIC最高的是11號(hào)引物，最低的是18號(hào)引物。

擴(kuò)增得到24個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）為2.32～10.32，18號(hào)引物最少，11號(hào)引物最多，平均6.26個(gè)。各引物的觀測(cè)雜合度（Ho）為0.15～0.96，23號(hào)最低，22號(hào)最高，平均為0.50。各引物的期望雜合度（He）為0.57～0.91，18號(hào)最低，11號(hào)最高，平均為0.81。Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.99～2.61，18號(hào)最低，11號(hào)最高，平均為1.98。

2.2?26個(gè)赤芝菌株的遺傳多樣性分析

對(duì)26份赤芝菌株的遺傳一致性和遺傳距離進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。26份靈芝菌株間的遺傳一致性變異范圍為0.28～0.95，平均遺傳一致性為0.58;遺傳距離為0.06～0.73，平均遺傳距離為0.42。其中，赤芝KG（X15）和靈2（X22）間遺傳相似系數(shù)最小，遺傳距離最大，說(shuō)明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn);泰山靈芝（X10）和赤芝KG（X15）間遺傳相似系數(shù)較大，遺傳距離最小，說(shuō)明二者親緣關(guān)系較近。

2.3?26個(gè)赤芝菌株的聚類分析

通過(guò)UPGMA法利用遺傳距離系數(shù)對(duì)26份赤芝菌株種質(zhì)資源材料進(jìn)行聚類分析，如圖1所示。在遺傳距離為0.17的閾值處，可將26份赤芝菌株分為4個(gè)類群，第1類群由古田赤芝、赤芝GL108、CGMCC5.67、赤芝G201、赤芝G10、赤芝G1、武夷靈芝、靈2、CGMCC5.0026、赤芝6號(hào)、赤芝Ga66等菌株組成，第2類群由美大靈芝、韓國(guó)靈芝（藥植所）、CGMCC5.65等組成，第3類群由赤芝26、韓國(guó)靈芝（冠縣）、赤芝G202、鹿角靈芝和多孢靈芝等組成，第4類群由泰山靈芝（武漢）、赤芝LQ2、中國(guó)靈芝、赤芝LQ1、泰山靈芝（冠縣）、赤芝KG和CGMCC5.425等組成。由圖1可知，除泰山靈芝和龍泉靈芝外，部分來(lái)自同一地區(qū)的菌株并未聚集在同一類群里。

4?討論

靈芝在我國(guó)有2 000多年的栽培歷史，現(xiàn)代靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，所具價(jià)值也日益凸顯。近年來(lái)，靈芝栽培技術(shù)及加工技術(shù)得到一定的發(fā)展，但存在種植技術(shù)落后，新品種少，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊等問(wèn)題[16]。而赤芝種質(zhì)資源的研究與保護(hù)尚屬起步階段，高品質(zhì)赤芝產(chǎn)品沒(méi)有保障，阻礙了其市場(chǎng)品牌建設(shè)步伐。由于赤芝子實(shí)體形態(tài)會(huì)受到外界環(huán)境的影響，例如，通過(guò)調(diào)控栽培條件赤芝可由正常狀態(tài)生成鹿角狀;一些形態(tài)相近的古田靈芝、開平靈芝等會(huì)被用作赤芝使用[17]。靈芝栽培歷史悠久，研究人員也在不斷進(jìn)行品種選育工作。傳統(tǒng)的遺傳育種實(shí)踐中，一般是以產(chǎn)量、形態(tài)、有效成分等性狀為指標(biāo)，基于現(xiàn)有的種質(zhì)資源，通過(guò)表型選擇進(jìn)行農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)移與改良。朱惠照等人通過(guò)對(duì)浙江的野生赤芝馴化，首先選育出“仙源5號(hào)”，又以其為出發(fā)菌株，進(jìn)行選育得到了“仙芝1號(hào)”[18]。隨后張蕾等人經(jīng)過(guò)航天育種，在“仙芝1號(hào)”基礎(chǔ)上得到“仙芝2號(hào)”[19]。劉新銳等人以“南韓靈芝”和“G8-2”為親本，通過(guò)原生質(zhì)體單核化雜交，篩選獲得靈芝新品種“芝102”[20]。傳統(tǒng)選育方法得到的赤芝菌種具有產(chǎn)量高、朵型好及產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也存在著周期較長(zhǎng)、遺傳改良效率偏低等問(wèn)題。此外，在赤芝選育過(guò)程中，經(jīng)常使用菌絲的拮抗實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證菌株間的親緣關(guān)系，效率較低且工作量較大。因此，采用有效的分子標(biāo)記研究其遺傳多樣性，可為赤芝優(yōu)良品種的引種與選育提供理論基礎(chǔ)。

SSR標(biāo)記作為可靠、高效且簡(jiǎn)單易操作的標(biāo)記技術(shù)，用于植物遺傳育種方面的研究主要包括構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜、基因定位和QTL分析、品種鑒定與指紋圖譜構(gòu)建、分子輔助選擇育種及遺傳多樣性分析[21-22]。分子標(biāo)記輔助選擇育種將分子生物學(xué)與傳統(tǒng)育種結(jié)合起來(lái)，分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，以獲得目標(biāo)性狀的基因型，從而提高育種效率。例如，Gupta等利用代表谷子9條染色體的50個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)184個(gè)不同地方的谷子進(jìn)行了基因分型。并利用基于遺傳距離的聚類方法和基于一般模型的聚類方法對(duì)這些遺傳多樣性進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的關(guān)鍵信息關(guān)聯(lián)分析，確定了8個(gè)與谷子9個(gè)農(nóng)藝性狀之間存在顯著的關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，可有效地應(yīng)用于谷子育種[23]。從全基因組序列中開發(fā)SSR引物，對(duì)收集的赤芝菌株進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，并進(jìn)行聚類分析和指紋圖譜分析，明確赤芝品種的遺傳基礎(chǔ)，建立品種的鑒定方法，為赤芝品種的親本選配和遺傳改良提供理論依據(jù)，是推動(dòng)靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題之一。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)在赤芝菌株遺傳多樣性方面的研究較少。前期，張肖雅等人利用其他來(lái)源的8對(duì)SSR引物對(duì)11個(gè)靈芝菌株進(jìn)行擴(kuò)增，并用電泳法對(duì)其多態(tài)性條帶進(jìn)行分析，每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)量在2～6之間[24]。本文利用60對(duì)引物對(duì)赤芝26個(gè)菌株進(jìn)行SSR分析，篩選出24對(duì)具有多態(tài)性的引物，每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)量在5～19之間。各引物的多態(tài)信息含量（PIC）為0.57～0.91，平均為0.81。數(shù)據(jù)表明，基于赤芝基因組開發(fā)的SSR位點(diǎn)能更好的體現(xiàn)菌株間的遺傳多樣性。

利用SSR標(biāo)記分析26個(gè)赤芝菌株的遺傳一致性系數(shù)，得到各菌株間遺傳一致性系數(shù)平均值為0.58，變化范圍為0.28～0.95，UPGMA聚類結(jié)果顯示菌株分類與其來(lái)源地?zé)o明顯相關(guān)性。劉雪瑩等人利用ITS序列對(duì)中國(guó)8個(gè)不同地理群體的168份靈芝樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，顯示野生赤芝不同地理群體間的遺傳變異占4.33%，群體內(nèi)的變異占95.67%，說(shuō)明中國(guó)野生赤芝的遺傳分化主要來(lái)自于群體內(nèi)部[25]。本研究中，少部分來(lái)自同一地區(qū)的聚在一支上，如第一支中來(lái)自福建的古田赤芝和赤芝G201（遺傳一致性為0.71），第三支中來(lái)自湖北武漢的鹿角靈芝和多孢靈芝（遺傳一致性為0.93），第四支中來(lái)自龍泉的LQ1和LQ2（遺傳一致性為0.85），這些菌株親緣關(guān)系較近。此外，來(lái)自冠縣和湖北的泰山靈芝遺傳一致性系數(shù)高達(dá)0.94，說(shuō)明2個(gè)菌株可能為同一菌種。但是，更多來(lái)自同一地區(qū)的赤芝菌株并未聚集在同一支，顯示出豐富的遺傳多樣性，可能是由不同地區(qū)之間的相互引種、選育方式等原因造成。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)篩選的SSR標(biāo)記可以清楚的反映各菌株間的親緣關(guān)系。因此，在今后赤芝菌株的育種工作中，可選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的優(yōu)良品種作為親本，以促進(jìn)赤芝優(yōu)良品種選育工作，豐富用于栽培的菌株資源。

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（2020-02-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）