盧富華 李明玥 魏妙潔 石林春 劉金欣

摘要?水蛭基原復(fù)雜、市場(chǎng)混亂、傳統(tǒng)方法難以有效鑒別，臨床用藥的安全性無法保障。分子鑒定方法根據(jù)生物間的分子特征差異進(jìn)行鑒定，不受自然環(huán)境、生長發(fā)育階段等外部因素影響，具有快速、準(zhǔn)確、客觀的特點(diǎn)。目前應(yīng)用于水蛭的分子鑒定方法有：基于核酸的RAPD技術(shù)、SSR技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)和基于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE技術(shù)、同工酶分析技術(shù)，本文在簡(jiǎn)述水蛭不同分子鑒定方法研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，對(duì)水蛭不同分子鑒定方法的技術(shù)和應(yīng)用特點(diǎn)進(jìn)行比較，最后對(duì)DNA宏條形碼技術(shù)、Target-sequencing技術(shù)、電化學(xué)傳感檢測(cè)技術(shù)在水蛭混合物，特別是中成藥中水蛭成分的鑒定進(jìn)行展望，旨在為水蛭鑒定方法的深入研究提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞?水蛭;混偽品;鑒定;分子鑒定;PCR;DNA條形碼鑒定;蛋白質(zhì)標(biāo)記;下一代測(cè)序

Research Progress on Molecular Identification of Leech

LU Fuhua， LI Mingyue， WEI Miaojie， SHI Linchun， LIU Jinxin

（Engineering Center of Traditional Chinese Medicine Resources of Ministry of Education; Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100193， China）

Abstract?The origin of leech is complex， and its market is mixed and difficult for identification.The safety of clinical medication cannot be guaranteed.The molecular identification method is based on the difference of molecular characteristics between organisms， which is not affected by external factors such as natural environment， growth and development stage etc.And it has the characteristics of rapidity， accuracy and objectivity.At present， the molecular identification methods used in leeches are as follows：RAPD technique based on nucleic acid， SSR technique， DNA barcode technique， protein based SDS-PAGE technique， and isozyme analysis technique.Based on the research progress of different molecular identification methods of leeches， this paper compared the characteristics of their technology and application features.Finally， the method of combining DNA metabarcoding technique， target sequencing technique and electrochemical sensing detecting technique were predicted to be a potential method to identify leech components in the leech mixture or in the Chinese patent medicine， providing reference for the further study of the molecular identification methods of leeches.

Keywords?Leech; Mixed artifacts; Identification; Molecular identification; PCR; DNA barcoding identification; Protein labeling; Next-generation sequencing

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.003

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，是我國傳統(tǒng)的活血化瘀藥。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定水蛭藥材為水蛭科動(dòng)物螞蟥（寬體金線蛭）Whitmania pigra Whitman、水蛭（日本醫(yī)蛭）Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蟥（尖細(xì)金線蛭）Whitmania acranulata Whitman的干燥全體，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功能，主治血瘀經(jīng)閉，癥瘕痞塊、中風(fēng)偏癱、跌打損傷[2]。水蛭中含有多種抗凝劑，已發(fā)現(xiàn)的可直接作用于凝血系統(tǒng)的成分有水蛭素、吻蛭素、類肝素、組胺等[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明水蛭在防治動(dòng)脈粥樣硬化、抗凝血、抑制血栓、抗腫瘤等方面具有良好的療效[4-8]。近年來，我國以水蛭為原料藥材的中成藥有90余種[9-10]，其中通心絡(luò)膠囊、腦血康滴丸、腦心通膠囊等中成藥被納入2019年的《國家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)藥品目錄》[11]。近年來，水蛭市場(chǎng)需求銳增、生態(tài)環(huán)境不斷惡化、群眾濫捕濫捉使得水蛭野生資源大幅減少，水蛭價(jià)格顯著上漲[12-13]，不法商販常使用混偽品、肚內(nèi)填充異物、加明礬腌漬、加鹽增重等摻假手段來謀利[14]，亟需建立準(zhǔn)確有效的水蛭藥材真?zhèn)舞b別方法，為水蛭藥材的臨床用藥安全與療效提供有力保障。

傳統(tǒng)鑒定方法因受到遺傳可變性[15]、表形可塑性[16]、化學(xué)成分復(fù)雜性[17]的影響，常常具有一定的局限性。20世紀(jì)70年代末期以來，隨著分子生物學(xué)和信息學(xué)的快速發(fā)展，產(chǎn)生了更加直接、準(zhǔn)確的分子鑒定方法。1980年，Botsein等[18]提出限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP），其基本原理是基因組經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，通過Southern印跡和特定序列探針雜交后顯示出遺傳位點(diǎn)的等位變異，結(jié)果穩(wěn)定可靠，但操作復(fù)雜、耗時(shí)較長，實(shí)踐中常使用與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）結(jié)合的PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行鑒定。期間，蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)[19]被廣泛應(yīng)用于分子診斷。1990年，Williams等[20]提出以PCR為基礎(chǔ)的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）技術(shù)，但擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性較差。簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）通過設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，快速穩(wěn)定，且多態(tài)性較高，呈共顯性遺傳，被廣泛用于種質(zhì)鑒定[21]。1993年，Zabeau Mare和Vos Pieter[22]發(fā)明了擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)（AFLP），其基本原理是對(duì)基因組酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。1991年，香港中文大學(xué)邵鵬柱團(tuán)隊(duì)[23]運(yùn)用了RAPD和隨機(jī)引物PCR技術(shù)（AP-PCR）在人參與西洋參中進(jìn)行DNA指紋鑒別，發(fā)表了第一篇中藥分子鑒定英文論文。1994年，Zietkiewicz等[24]提出了簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（ISSR）。目前，2010年版《中華人民共和國藥典》[25]收載了蘄蛇、烏梢蛇的PCR鑒定方法，2015年版《中華人民共和國藥典》增補(bǔ)本已公示金錢白花蛇的快速PCR鑒定方法[2]。此外，川貝母的PCR-RFLP鑒定方法也被納入了2015年版《中華人民共和國藥典》[2]。

2003年，Hebert等[26]首次提出DNA條形碼技術(shù)，這是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來鑒定物種的一種分子生物學(xué)技術(shù)，不受經(jīng)驗(yàn)限制與環(huán)境影響，已成功應(yīng)用于僵蠶[27]、水牛角[28]、金錢白花蛇[29]、哈蟆油[30]等動(dòng)物藥材鑒定研究。2014年，石林春等[31]構(gòu)建了包含800余種動(dòng)物藥材及其混偽品和密切相關(guān)物種的“中國動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫”。許多優(yōu)秀的中藥分子鑒定專著也先后出版，如《中藥DNA條形碼分子鑒定》[32]《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》[33]等。2010年版《中華人民共和國藥典》增補(bǔ)本正式收載中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則[25]，標(biāo)志著中藥分子鑒定成為繼四大經(jīng)典方法之后的新鑒定方法。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，更多的基因信息可被獲得，基因信息的開發(fā)、利用以及基因信息庫的構(gòu)建使得分子鑒定技術(shù)全面推廣。2018年，陳士林等出版了“十三五”規(guī)劃教材《本草基因組學(xué)》專著[34]，引領(lǐng)現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用，也為中藥分子鑒定提供更多的資源。

水蛭的分子鑒定方法隨著中藥分子鑒定技術(shù)的進(jìn)步而不斷發(fā)展，見圖1。本文將從DNA分子鑒定和蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)兩大類簡(jiǎn)述近年來水蛭分子鑒定方法的研究進(jìn)展，分析總結(jié)不同分子鑒定技術(shù)在水蛭藥材真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用特點(diǎn)，旨在為今后水蛭分子鑒定方法的深入研究提供參考和借鑒。

1?DNA分子鑒定

DNA分子鑒定技術(shù)[35]是從核酸層面對(duì)中藥材進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，包括基于PCR的分子鑒定技術(shù)以及DNA條形碼技術(shù)，其中DNA條形碼鑒定技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。

1.1?基于PCR的分子鑒定技術(shù)

直接PCR技術(shù)[36]以微量組織樣品的裂解物為DNA模板，借助靈敏、抗干擾能力強(qiáng)的Taq DNA聚合酶進(jìn)PCR擴(kuò)增。SNP分子標(biāo)記能夠?yàn)槠贩N鑒定提供準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)渠道[37]。在水蛭鑒定中，常用的PCR分子鑒定技術(shù)有簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)（ISSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）。Liu等[38]采集了全國螞蟥分布區(qū)的八個(gè)省份的樣本，用ISSR和SRAP對(duì)遺傳多樣性在物種水平上進(jìn)行研究，SRAP與ISSR結(jié)果較為一致，聚類分析表明螞蟥種群間有較高水平的遺傳分化。與SRAP相比，ISSR的顯性表現(xiàn)及通用性會(huì)更好，穩(wěn)定性高，且無需預(yù)先克隆和測(cè)序，但I(xiàn)SSR準(zhǔn)確性稍弱。劉飛等[39]采集了225個(gè)螞蟥樣本，利用RAPD進(jìn)行遺傳多樣性分析，聚類分析結(jié)果表明在物種水平上群體間分化較大，種群內(nèi)存在一定程度變異，與Liu等結(jié)果較為一致。劉飛等[39]還對(duì)螞蟥進(jìn)行了SSR開發(fā)，利用和生物素特異性結(jié)合、限制性內(nèi)切酶消化的2種策略建立SSR文庫，結(jié)果2種方法都可高效開發(fā)出SSR序列。

1.2?DNA條形碼鑒定技術(shù)

DNA條形碼鑒定技術(shù)是通過利用標(biāo)準(zhǔn)DNA片段對(duì)物種進(jìn)行鑒定的方法。中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則提出動(dòng)物類藥材采用細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（COI）序列為主，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)間2（ITS2）為輔的中藥材鑒定體系[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[40-41]，在應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)水蛭鑒定時(shí)，常用COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA等分類序列，其中COI是進(jìn)化較快的序列。

Elizabeth等[42-43]針對(duì)蛭綱53個(gè)物種進(jìn)行了COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA序列分析，得到系統(tǒng)進(jìn)化分類結(jié)果與傳統(tǒng)的分類學(xué)結(jié)果不完全一致，認(rèn)為有3個(gè)物種應(yīng)歸為醫(yī)蛭科，歐洲山蛭的3個(gè)新物種實(shí)際可能是南美洲山蛭的入侵物種。劉飛等[44]對(duì)寬體金線蛭及水蛭的DNA序列進(jìn)行ITS測(cè)序分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)分類結(jié)果與分類學(xué)結(jié)果不完全一致，與Elizabeth等的結(jié)果相似，究其原因可能是ITS序列在進(jìn)化時(shí)發(fā)生了堿基間的轉(zhuǎn)換、顛換和缺失等少量位點(diǎn)變異。同年，Lai Y T.等[45]對(duì)臺(tái)灣的幾個(gè)黃蛭科新種利用COI、12S rRNA、16S rRNA的部分片段對(duì)進(jìn)行分析，結(jié)果可成功實(shí)現(xiàn)種類鑒定。此后，劉曉帆[46-47]采集的12個(gè)水蛭樣品（螞蟥、水蛭、柳葉螞蟥與其混偽品菲牛蛭、天目山蛭等）在條形碼長度及GC含量上均有差異，在N-J遺傳樹中水蛭正品來源與各種混偽品不聚集在一起，可將水蛭藥材與混偽品區(qū)分，菲牛蛭與水蛭十分相近，但還是各自分成獨(dú)立的一支。說明各物種相互之間可明顯區(qū)分，因此得出基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)適用于藥材水蛭的鑒定。徐云玲等[48-50]增加了與劉曉帆等不同物種的水蛭（光潤金線蛭、八目石蛭），對(duì)COI、12S和16S基因進(jìn)行測(cè)序來構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，發(fā)現(xiàn)每種水蛭均形成獨(dú)立分支，成功將這6種水蛭進(jìn)行鑒定分類，也得出了與此前研究相同的結(jié)果。肖凌[51]對(duì)寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、尖細(xì)金線蛭、菲牛蛭、棒紋牛蛭、光潤金線蛭、日本山蛭及八目石蛭共8個(gè)物種進(jìn)行鑒定，比之前的研究又增加了新物種與新基因片段序列（ITS2、COI、12S rRNA、16S rRNA等），考察序列種間、種內(nèi)變異的Barcoding Gap，最后也得出相同結(jié)論，還提出了可將12S rRNA作為醫(yī)用蛭類較為合適的DNA條形碼序列。綜上所述，應(yīng)用COI及12S rRNA聯(lián)合序列在種內(nèi)保守、種間差異較大的片段設(shè)計(jì)特異引物可準(zhǔn)確鑒別水蛭藥材與混偽品。

2?蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)

蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)[52]是從蛋白質(zhì)層面對(duì)中藥材進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，包括抗血清鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)、同工酶鑒定技術(shù)以及蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)，但將抗血清鑒定技術(shù)運(yùn)用于水蛭鑒定還需進(jìn)行進(jìn)一步研究探索。

2.1?蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)

蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)[52]是依據(jù)中藥中所含蛋白質(zhì)分子的大小、形狀或所帶電荷差異，采用電泳分離來鑒定中藥的方法，常用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和毛細(xì)管電泳（CE）。丁月珠[53]對(duì)螞蟥清水吊干品、菲牛蛭干品、菲牛蛭鮮品采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法檢測(cè)3種水蛭樣品對(duì)纖維蛋白原的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)螞蟥清水吊干品對(duì)纖維蛋白原有水解作用，尤其是對(duì)α、β鏈的作用較強(qiáng)，而菲牛蛭干品與菲牛蛭鮮品對(duì)纖維蛋白原均無此作用。因此，SDS-PAGE法可將螞蟥與菲牛蛭成功鑒別。

2.2?同工酶鑒定技術(shù)

同工酶鑒定技術(shù)[52]是依據(jù)待鑒定中藥中同工酶的分子結(jié)構(gòu)、活性以及免疫原性等的特異性，使用酶活性分析、電泳檢測(cè)等技術(shù)來鑒定中藥品種的方法。羅媛媛等[54]對(duì)日本醫(yī)蛭和天目山蛭的4種同工酶（ES、MDH、POX、LDH）采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行比較研究，結(jié)果顯示4種同工酶在日本醫(yī)蛭和天目山蛭中的表達(dá)程度和LDH同工酶譜對(duì)比具有相似性，說明日本醫(yī)蛭和天目山蛭在遺傳上具有一定相似性，可能存在一定親緣關(guān)系。這與分類學(xué)結(jié)果相吻合，其同屬于無吻蛭目醫(yī)蛭形亞目。

2.3?蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)

蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)[52]采用了飛行時(shí)間質(zhì)譜與熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)中藥中所含肽和蛋白質(zhì)種類組成進(jìn)行分析來鑒定中藥的方法，可建立出動(dòng)物類中藥蛋白或肽成分的質(zhì)量指紋圖譜，在羚羊角[55]、阿膠[56]、地龍[57]等藥中已成功應(yīng)用。Baskova[58]利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)水蛭唾液腺分泌物蛋白做分析，從而辨析出幾種水蛭蛋白的組成異同，實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平上的高效、高通量分離鑒定。此方面的實(shí)驗(yàn)[59-61]應(yīng)用在水蛭中大多是采用電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）或質(zhì)譜技術(shù)對(duì)水蛭藥材重金屬元素進(jìn)行檢測(cè)研究，在使用蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)水蛭進(jìn)行鑒定還需進(jìn)一步探索研究。

3?討論

3.1?水蛭市場(chǎng)現(xiàn)狀

2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的中藥材水蛭的基原物種為水蛭科動(dòng)物螞蟥、水蛭或柳葉螞蟥，然而市場(chǎng)常見品種主要為寬體金線蛭，日本醫(yī)蛭數(shù)量極少，甚出現(xiàn)大量非藥典規(guī)定的水蛭品種制作的水蛭藥材，如牛蛭屬的菲牛蛭、湖北牛蛭等[62]。中藥材水蛭市場(chǎng)比較混亂，其原因是多方面的：一是各地用藥習(xí)慣的差異。由于南北差異較大，各地用藥習(xí)慣有著顯著區(qū)別。菲牛蛭是西南水蛭的代表品種，被收錄進(jìn)2005年版《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[63]與2005年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[64]，它符合部分地方用藥標(biāo)準(zhǔn)，但卻不滿足2015年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。二是同科屬的水蛭品種性狀上的相似性常造成誤用現(xiàn)象。常規(guī)性狀鑒定只能區(qū)分到科級(jí)別，若需定種，則須觀察環(huán)節(jié)數(shù)、生殖孔等細(xì)微特征，然而在加工成藥材的過程中，這些細(xì)微的特征常遭到破壞，大大增加了性狀鑒定的難度。并且水蛭的性狀會(huì)受到外界環(huán)境變化的影響，不同地區(qū)的水蛭在大小，性狀上也存在著細(xì)微差別，這些都對(duì)水蛭藥材的常規(guī)鑒定提出了挑戰(zhàn)。水蛭藥材及其各種混偽品的粉末在顯微鏡觀察下差異較小[42]，無法通過顯微鑒定辨別真?zhèn)?。而在藥材薄層鑒定中，可能是由成分含量的差異不明顯，正品和偽品與標(biāo)準(zhǔn)藥材在相同位置形成相同顏色的點(diǎn)[30]，無鑒別意義。三是水蛭藥材品種的歷史遺留問題。關(guān)于水蛭的藥用品種始終存在爭(zhēng)議。通過本草考證，我們可以發(fā)現(xiàn)各古籍文獻(xiàn)中對(duì)于水蛭的藥用品種描述均不夠詳細(xì)，只是簡(jiǎn)單地強(qiáng)調(diào)了一下水蛭的藥用品種不包括石蛭、泥蛭、山蛭及其諸小者，并且藥用水蛭以“小者為佳”，并不涉及水蛭藥用品種的具體形態(tài)特征的描述，如《蜀本草》[65]記載：“勿誤采石蛭、泥蛭用。石、泥二蛭，頭尖，腰粗，色赤，不入藥，誤食之，則令人眼中如生煙，漸至枯損”。關(guān)于水蛭的藥用品種始終存在爭(zhēng)議，一些文章也對(duì)水蛭在藥典中規(guī)定的品種提出了增補(bǔ)修改建議[66]。四是供需缺口的擴(kuò)大致使不法商販摻假混用。由于近年來水蛭市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，然而現(xiàn)有藥用品種的水蛭野生資源大幅減產(chǎn)，且相關(guān)人工養(yǎng)殖技術(shù)仍不夠成熟，無法供應(yīng)水蛭藥材需求，造成藥材價(jià)格連年上漲，不法商販因此打著進(jìn)口水蛭藥材品種[67]的幌子販賣非藥用品種的水蛭藥材。其中，由于海南菲牛蛭資源較多，且菲牛蛭干品具有明顯的抗凝抗血栓活性[68]，常被摻入混用。

3.2?分子鑒定技術(shù)在水蛭鑒定中的特點(diǎn)

基于PCR的分子鑒定技術(shù)具有多樣性[69]，最大的特點(diǎn)是以微量樣品為起始材料，高效擴(kuò)增物種基因片段，可顯著提高工作效率。當(dāng)有大量樣品需要處理時(shí)，這一優(yōu)勢(shì)則更為明顯，劉飛等[39]基于此種方法對(duì)225個(gè)螞蟥樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析就大大節(jié)省了時(shí)間和人力。DNA條形碼鑒定技術(shù)不受形態(tài)特征和生物個(gè)體發(fā)育的限制，且檢測(cè)樣本范圍廣，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，在中藥水蛭鑒定中已經(jīng)表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)可很好地鑒別水蛭、寬體金線蛭、尖細(xì)金線蛭、光潤金線蛭、日本山蛭、八目石蛭等物種，高效、準(zhǔn)確。由于COI序列長度較長（658 bp），傳統(tǒng)DNA條形碼技術(shù)對(duì)DNA嚴(yán)重降解樣品和混合樣品的鑒定較為困難，需要借助Mini-barcode技術(shù)[70]或聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒定。在蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)中，已有研究表明：SDS-PAGE法可鑒別螞蟥與菲牛蛭;同工酶鑒定技術(shù)可鑒定分離日本醫(yī)蛭和天目山蛭;表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)了對(duì)幾種水蛭蛋白的分離鑒定。因此，蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)在中藥水蛭鑒定中也發(fā)揮重要作用。隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物學(xué)以及操作技術(shù)的不斷更新，中藥鑒定實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)字化，中藥水蛭的鑒定方法在分子鑒定技術(shù)中也得到了進(jìn)一步發(fā)展與完善，各項(xiàng)分子鑒定技術(shù)也有其優(yōu)點(diǎn)與局限性，根據(jù)不同的特點(diǎn)可鑒定不同的水蛭品種，可見表1。

3.3?總結(jié)與展望

在傳統(tǒng)物種分類基礎(chǔ)上，結(jié)合基因分子水平進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育、遺傳進(jìn)化、系統(tǒng)分類等方面的研究，尋找不同物種間基因分子水平的差異，使得水蛭鑒定方法更加具有科學(xué)性與多樣性，DNA條形碼鑒定技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來，電化學(xué)傳感檢測(cè)技術(shù)備受關(guān)注，基于DNA測(cè)序、DNA/蛋白質(zhì)相互作用以及生物分子檢測(cè)等，靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，目前該技術(shù)已應(yīng)用在了魚類HIV病毒檢測(cè)方法構(gòu)建[71]、甘草提取液中大腸桿菌的快檢[72]，將該技術(shù)與納米技術(shù)結(jié)合成功實(shí)現(xiàn)將西紅花與它的6種摻假藥精確鑒別[73]。宏條形碼技術(shù)（DNA Metabarcoding）結(jié)合了DNA條形碼和高通量測(cè)序技術(shù)可以對(duì)混合樣本中所有物種的DNA片段進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，Jia等[74]基于ITS2和psbA-trnH片段，以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）對(duì)中成藥益母丸的成分進(jìn)行有效檢測(cè)鑒定。Xin等[75]結(jié)合了宏條形碼技術(shù)和SMRT技術(shù)對(duì)中成藥九味羌活丸進(jìn)行物種鑒定，結(jié)果可高效、靈敏地檢測(cè)九味羌活丸中各原藥材的基原。石林春等[76]利用宏條形碼技術(shù)對(duì)中成藥如意金黃散中的原料藥材進(jìn)行了物種基原識(shí)別鑒定，結(jié)果除厚樸外的全部處方成分均可被檢測(cè)到，鑒定出摻雜了混偽品朝鮮蒼術(shù)和虎掌南星。Shotgun metagenomics技術(shù)可以克服宏條形碼技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增成功率的依賴，Xin等[77]對(duì)市售中成藥龍膽瀉肝丸采用了Shotgun metagenomic sequencing進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中含有木通的混偽品。目標(biāo)測(cè)序技術(shù)（Target Sequencing）信息量大，可以完整覆蓋整個(gè)基因區(qū)域，獲得高頻SNP分型數(shù)據(jù)，對(duì)于低頻的和個(gè)體特有的變異也能夠識(shí)別，已成功應(yīng)用在了271個(gè)商業(yè)辣椒品種多態(tài)性的檢測(cè)鑒定[78]?？梢灶A(yù)見，這些新技術(shù)可應(yīng)用在中成藥中水蛭成分的鑒定，對(duì)中藥水蛭鑒定技術(shù)的發(fā)展起到推動(dòng)作用，使鑒定結(jié)果更加合理準(zhǔn)確，保障中藥水蛭在臨床中的有效應(yīng)用。

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（2020-02-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）