曲 杰，郭 靜，褚會松，呂喜英＊＊

（1. 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 承德 067000；2. 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 承德 067000）

鳳尾草又被稱為井口草、鳳凰草、山雞尾、雙鳳尾等，屬鳳尾蕨科植物，因其經(jīng)常在潮濕的地方生長而得名，如石隙、井邊和墻根等處[1]。鳳尾草生長區(qū)域較為廣泛，全國大部分地區(qū)均可采集到，主要集中在兩廣地區(qū)、福建、江蘇、貴州等地區(qū)，一年四季均能采集。鳳尾草是一種功效豐富，歷史悠久的中草藥，最早在唐朝《本草拾遺》中有記載，后于明代《中草藥性備要》中也曾描述其止血消毒的作用。不同的歷史時期均有書籍對鳳尾草的療效進行了記載，如《植物名實圖考》《分類草藥性》《本草推陳》和《廣西本草選編》等。直至新中國初期，鳳尾草在我國民間開始逐漸被廣泛使用。

隨著對鳳尾草的化學成分和治療效果的不斷研究，鳳尾草在臨床上的應用也較為常見，在抗炎消腫、抑制細胞氧化、影響體內(nèi)某些激素表達等方面均能發(fā)揮作用，甚至能起到抗腫瘤作用，另外其排毒消炎、散熱止血之功效不容小覷[2]。因此，鳳尾草治療較為廣泛，不但對呼吸消化泌尿系統(tǒng)、婦科炎癥、皮膚病、癌癥、出血癥等疾病起到顯著療效，而且在多種疑難雜癥的治療方面也能起到作用，如小兒驚風夜哭、跌打燙傷、貓狗咬傷、農(nóng)藥中毒、眼花牙痛、神經(jīng)麻痹等[3]。

目前，國內(nèi)外對鳳尾草的臨床研究也逐步發(fā)展起來，秦波等[4]研究了鳳尾草中的組成物質，從全草中分離出22 種化合物，包括黃酮類、萜類化合物、氨基酸、脂肪酸、揮發(fā)油等，其中含量最高的為黃酮類[5]。黃酮類是自然界較為常見的一種有機化合物，廣泛存在于植物中，且具有多種生物活性，因此在國內(nèi)外引起重視，得到廣泛研究。黃酮類化合物具有以下幾點特性：第一，黃酮類化合物的典型特征為能夠清除自由基，對感染性疾病、炎癥反應、燒傷燙傷及電離輻射等疾病起到治療作用[6]。第二，黃酮類化合物對人體內(nèi)的氧化還原反應起到影響作用，催化電子轉移，能作為保護機體的重要還原劑[7]。第三，黃酮類化合物能夠對多種生物酶具有抑制作用，如氧化還原酶、磷酸酯酶、蛋白酶、水解酶等[8]。第四，黃酮類化合物能夠影響機體內(nèi)激素水平的表達[9]，影響感官表達，協(xié)調(diào)神經(jīng)運動，減輕痛覺神經(jīng)等[10]。第五，黃酮類化合物能通過與重金屬離子結合起到解毒作用[11]，對心血管疾病、過敏反應、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥、胃腸道潰瘍等多種疾病均能起到顯著臨床療效[12]。據(jù)相關研究結果報道，鳳尾草和其他中草藥結合可以有效治療多種癌癥，如消化道和婦科等腫瘤[13]。雖然鳳尾草的應用廣泛，但是關于其對細胞遷移作用方面的研究很少，因此本研究主要研究了鳳尾草總黃酮（TFPM）濃度水平對肺癌A549 細胞體外遷移能力的影響，并探討其發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

細胞株從承德醫(yī)學院實驗室獲取人肺癌A549 細胞株。

1.1.2 藥物的制備

藥物的制備：承德醫(yī)學院提供鳳尾草樣品，并將其保存于干燥容器中備用。

1.1.3 主要試劑與主要儀器

主要試劑：胎牛血清（Gibco 產(chǎn)品）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco產(chǎn)品），濃度為0.25%的胰蛋白酶（Gibco產(chǎn)品），F(xiàn)GF4 抗體（Sigma 產(chǎn)品），辣根過氧化物酶標記的二抗（博奧森公司產(chǎn)品）。

主要儀器：DF-20M 離心機（湖南湘儀產(chǎn)品），CO2培養(yǎng)箱（美國NUAIRE 公司），顯微鏡（德國Leica 公司），生物安全柜（上海力康），培養(yǎng)皿（美國Corning 公司），高壓消毒鍋（日本雅馬拓公司產(chǎn)品），分光光度計（HP Agilent），EL104電子天平（梅特勒-托利儀器上海有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

在溫度37℃、CO2濃度5%的條件下，將A549 細胞置于RPMI-1640 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并以胰酶消化，通過顯微鏡觀察細胞生長并提取對數(shù)生長期A549 細胞株。

1.2.2 制備TFPM溶液

提取儲存良好的鳳尾草干燥全草200 g 并進行粉碎，準備濃度為70%的乙醇溶液，將二者分別以1:20的比例進行配伍，在60℃的條件下提取2 h，共提取2次[14-15]。將2 次的提取液融合、凍干后得5.0 g 干燥固體。取磷酸鹽緩沖溶液（PBS 溶液）500 mL 將其溶解于所得固體中，利用高速離心機以15000 r/min 分離15 min，共進行 3 次。將離心后的上清液用 0.22 μm 過濾器過濾，滅菌，并置于冰箱中，溫度設定為4℃進行保存。最終獲得溶液采用蘆丁作為對照品并以NaNO2-A1(NO)3-NaOH 顯色，紫外分光光度法在510 mm 處測得總黃酮含量[16]。以蘆丁的形式制備總黃酮含量為10 mg/mL的溶液。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察

備好的6孔培養(yǎng)板中每孔各接種1 mL 的A549 細胞懸液，并分別在其中加入濃度為10 mg/ mL、5 mg/mL、2.5 mg/ mL、1.25 mg/ mL 的 TFPM 和不含 TFPM的PBS 溶液各100 μL 進行培養(yǎng)，各組進行對照。每24 h觀察每孔中腫瘤細胞形態(tài)并詳細記錄。

1.2.4 細胞劃痕實驗

在6 孔培養(yǎng)板上鋪展后，A549 細胞系逐漸生長，在覆蓋劃痕后，用PBS 溶液洗滌并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別在0 h 和24 h 對劃痕距離進行測量并記錄。

1.2.5 Transwell 實驗

取對數(shù)生長期的A549 細胞中加入胰酶，RPMI-1640 培養(yǎng)基制備約5×105/mL 個細胞的懸液并進行鋪板。RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含15%的小牛血清）置于24 孔培養(yǎng)板中，每孔各 600 μL。將 100 μL 的 A549細胞懸液和10 μL 1%的 BSA 溶液置于Transwell 的上室中，最終以濃度為0.1%的BSA 溶液維持上室內(nèi)滲透壓。各上室中分別加入100 μL 不同濃度的TFPM 和 PBS 溶液，各下室中各分別加入 600 μL 的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，濃度為5%，溫度為37℃，時間為24 h。最后，將培養(yǎng)基用90%乙醇固定，消毒棉擦拭上室面和0.1%結晶紫溶液漂染下室面，風干處理好樣本后顯微鏡觀察并記錄。選取4 個視野（×400）內(nèi)的細胞算平均值（共進行3 次）。

1.2.6 Westen blot實驗

提取細胞數(shù)約為5×106個的A549 細胞原液和加入TFPM 后的A549 細胞，并在其中分別加入細胞裂解液300 μL。半小時后，將其轉移至1.5 mL EP 管中，并在4℃下以12000 r/min 離心。將離心4 min 后的上清液置于-20℃溫度保存。采用BCA 法測定其中蛋白濃度。上樣量蛋白含量為40 ng 并進行電泳（80 V 下30 min，120 V 下 90 min）。在 PVDF 膜上用 PBST 溶液（含有5%脫脂奶粉）密封，經(jīng)過2 h 后加入FGF4 抗體（1：500）和抗β-actin 抗體（1：500），溫度保持在4℃的條件下過夜。PBST 液洗15 min 取膜后蛋白，洗過3 遍后，室溫下二抗（1：3000）封閉。1 h 后PBST 液再洗10 min，洗過3 遍后取出。用X-光片記錄化學發(fā)光法檢測的所得溶液。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 腫瘤細胞形態(tài)學變化

實驗結果分為兩組，實驗組為TFPM 處理（以5 mg/mL 和 10 mg/mL 為例）后的細胞，對照組為 PBS 處理后的細胞。以下結果均以此兩濃度藥物處理組為例，實驗均重復3 次，結果較為一致。結果顯示，分別在0 h 和24 h 觀察腫瘤細胞生長，對照組A549 細胞生長較為均勻，貼壁現(xiàn)象明顯，且細胞規(guī)則清晰、形態(tài)飽滿；實驗組A549 細胞生長速度明顯減慢，細胞明顯壞死縮小，細胞生長貼壁不明顯，且此現(xiàn)象與TFPM 濃度有關，TFPM 濃度越高，此現(xiàn)象越明顯，兩者呈正相關關系，見圖1。

2.2 劃痕實驗

兩組細胞經(jīng)過劃痕后出現(xiàn)相同的無細胞區(qū)，經(jīng)24 h 后對照組無細胞區(qū)內(nèi)細胞覆蓋明顯，腫瘤細胞幾乎全部遷移至無細胞區(qū)；而實驗組無細胞區(qū)細胞覆蓋不明顯，仍有無腫瘤細胞遷移區(qū)，且5 mg/mL組細胞遷移比 10 mg/mL 組更明顯（P＜0.05），見圖2。

2.3 Transwell 實驗

對照組和5 mg/mL、10 mg/mL TFPM組穿膜細胞數(shù)分別為(36.91±4.47)、(18.05±2.04)、(6.35±2.32)，兩組差異顯著（P＜0.01）。TFPM 的濃度顯著影響跨膜細胞的數(shù)量，5 mg/mL 組較10 mg/mL 組穿膜細胞數(shù)增加（P＜0.01），兩者之間存在負相關，見圖3。

2.4 Westen blot實驗

實驗組FGF4 蛋白水平與對照組相比明顯減少（P＜0.05），且TFPM 濃度為10 mg/mL 組較5 mg/mL 組減少更明顯（P＜0.05），見圖 4。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)學變化

圖2 劃痕實驗細胞遷移情況

圖3 Transwell實驗，HE染色×400倍

圖 4 Westen blot 實驗

3 討論

作為常見的腫瘤，肺癌目前已成為癌癥致死的首要病因[17]。根據(jù)美國國家癌癥中心2018 年發(fā)布的最新數(shù)據(jù)[18]，男性肺癌發(fā)病率及死亡率均居首位，女性發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居第二位，但死亡率仍為第一位，發(fā)病率和死亡率分別達到57.13/10 萬人和45.80/10萬人，成為人類生命健康的頭號“殺手”。肺癌的可怕之處不僅在于持續(xù)升高的發(fā)病率和死亡率，而且因其惡性程度較高，患者生活質量和預后大大降低。相關研究數(shù)據(jù)顯示，早期可手術患者手術治療后5 年生存率為60%左右，而存在轉移的晚期患者5 年生存率明顯下降，局部轉移為27%左右，遠處轉移僅為5%左右。由于肺癌患者臨床癥狀并不明顯，故約三分之二的患者發(fā)現(xiàn)較晚，因此總的5 年生存率大約為15%左右[19]。根據(jù)病理類型不同，肺癌可分為兩種類型：小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 又可大致分為肺鱗癌（squamous lung cancer）和非鱗非小細胞肺癌（non-squamous non-small cell lung cancer，non-sq NSCLC）。其中SCLC 約20%，屬未分化癌，因此具有較強的侵襲性，且轉移率較高，僅部分早期患者可手術。其余80%為NSCLC，因病理類型和分期不同，治療方法也不同，對于晚期患者主要采取多學科的綜合治療，但臨床療效并不理想[20]。近年來，隨著腫瘤分子生物學的不斷研究發(fā)展，晚期肺癌尤其是non-sq NSCLC，在分子靶向治療和免疫治療方面取得了重大進展，為臨床治療提供更多選擇，延長患者無進展生存 期（progression-free survival，PFS）和 總 生 存 期（overall survival，OS），提高患者生活質量（quality of life，QoL），但總體來說，NSCLC 患者比SCLC 患者預后相對較好，生存期更長[19,21]。

肺癌患者出現(xiàn)轉移將嚴重降低患者的存活時間和存活質量。轉移是惡性腫瘤的一種常見生物學現(xiàn)象，其發(fā)生過程較為復雜，受許多基因的調(diào)控[22]。經(jīng)國內(nèi)外學者多年研究表明，肺癌出現(xiàn)轉移現(xiàn)象可能與患者體內(nèi)多種細胞因子表達異常關系密切[23]。細胞因子上有許多能調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及其相互作用的多肽分子，這些多肽分子能產(chǎn)生多種不同類型、不同功能的細胞[24]。值得注意的是，腫瘤細胞也能大量產(chǎn)生部分這類細胞因子，使得腫瘤細胞具有多種調(diào)節(jié)功能的細胞，如促使肺癌腫瘤細胞遷移的因子成為國內(nèi)外專家學者研究的重點，本實驗中主要針對成纖維生長因子4（FGF4）進行研究。成纖維細胞生長因子（FGF）存在于多種腫瘤細胞膜上，其基因編碼多種蛋白，是一個多基因家族[25]，在多種腫瘤細胞表面均可見到其表達，這表明FGF 可能與腫瘤細胞的增殖有關[26]。FGF4 細胞是其中的一種由多種細胞產(chǎn)生的蛋白，F(xiàn)olkman 等[27-28]相關研究結果認為，F(xiàn)GF4 不但能參與機體的炎癥反應、促進血管形成和瘢痕愈合，還能通過作用于細胞的接觸抑制、游離、變形、穿膜、附著等多個過程從而影響腫瘤細胞的增殖分化和離散遷移[29]。

目前，臨床上應用的抗腫瘤藥物多為生物制劑或者化學合成的產(chǎn)物，存在較大的毒副作用，且往往達不到預期的臨床療效。我國作為許多天然藥物的盛產(chǎn)地，中草藥治療癌癥已經(jīng)被廣泛應用。

迄今為止，有許多關于中藥抗腫瘤的相關報道，其中包括中草藥的特有成分對腫瘤細胞中細胞因子影響的報道[30]。在對肺癌治療有效的中草藥中，鳳尾草中總黃酮含量對抗腫瘤作用和對細胞因子的影響進行深入研究?！侗静菔斑z》中記載，鳳尾草具有排毒殺菌、祛熱鎮(zhèn)痛及抗腫瘤作用，目前應用于多種疾病的治療。雖然鳳尾草中含有多種化學成分，但提純后TFPM 為最主要成分，其具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，TFPM 的作用主要有三方面：第一，抗菌作用：鳳尾草中的黃酮類化合物對多種細菌均有很強的抑制作用，如金葡菌、枯草桿菌、黑曲霉菌等，而對大腸桿菌、青霉菌的抑制作用較弱，對黃曲霉菌則沒有見到抑制作用[31]。第二，抗腫瘤作用：顏大海等[32]對鳳尾草的實驗研究結果顯示，鳳尾草能激活纖溶系統(tǒng)，阻止血小板的聚集，抑制新生毛細血管，進而降低腫瘤所致的高凝狀態(tài)，抑制腫瘤細胞的粘附遷移能力。王剛等[33]利用小鼠作為動物實驗，將腫瘤細胞注射至小鼠體內(nèi)，測定鳳尾草中的提取物對腫瘤細胞的抑制作用及小鼠脾細胞的增殖作用。實驗結果為鳳尾草提取物能顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細胞，促進脾細胞的增殖，且此現(xiàn)象呈劑量依賴性。第三，保肝作用：劉建群等[34]實驗結果顯示鳳尾草提取物可有效降低肝損傷的小鼠體內(nèi)轉氨酶水平。

目前，對于黃酮類化合物的臨床研究報道也較為常見。黃酮類化合物作為大自然中的天然產(chǎn)物，在食物中得到廣泛應用，不但能作為多功能食品添加劑，如甜味劑、色素、抗氧化劑等，還能作為生物食品應用，起到防氧化抗衰老、抗癌、降脂降壓等功效。除在食品領域的廣泛應用，黃酮類化合物在醫(yī)療和農(nóng)業(yè)方面的應用也很常見，如各種特效藥和殺蟲劑等。雖然生物黃銅具有多種功效，但人體內(nèi)卻不能正常合成，且體外攝取的生物類黃酮在機體內(nèi)代謝較快，不能長期儲存。生物類黃酮在植物中較常見，人體主要通過各種飲品攝取，如咖啡、飲料、茶、酒水等，但雖然攝取途徑很多，但攝取量卻遠遠達不到獲益水平。近年來對生物黃酮類的研究得到越來越多的重視，應用也越來越廣，但機體如何消化吸收、在體內(nèi)的代謝過程等機理仍未全面認識，且其在抗腫瘤作用及其作用機制方面的研究并不多見。故本研究將肺癌A549 細胞作為實驗對象，初步研究TFPM 與腫瘤細胞生長繁殖及細胞因子FGF4 蛋白表達水平之間的相互關系，了解其抑制細胞遷移發(fā)生的可能相關機制。

實驗結果顯示，TFPM 阻止肺癌A549 細胞遷移作用明顯，腫瘤細胞內(nèi)FGF4 蛋白水平隨之減少，且隨著TFPM 濃度的增加，這種現(xiàn)象越明顯。相關研究顯示，肺癌轉移可能與細胞內(nèi)FGF4 蛋白表達水平上升有關[35]，因此，A549 細胞中 FGF4 蛋白減少可能是 TFPM抑制肺癌細胞遷移的作用機制，但該結論還有待進一步研究論證。