仇蓮胤，闕華發(fā)，屈可伸，孫 偉，郭樹(shù)豫，李 陽(yáng)

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

糖尿病性潰瘍是糖尿病患者常見(jiàn)而又嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病患者致殘和致死的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的身心健康及生命質(zhì)量，是臨床亟待解決的難題。顧氏外科是我國(guó)著名的中醫(yī)外科世家，長(zhǎng)期致力于慢性皮膚潰瘍的治療，療效顯著。傳承顧氏外科學(xué)術(shù)思想與臨證經(jīng)驗(yàn)，本課題組開(kāi)展了中醫(yī)藥治療糖尿病性潰瘍?nèi)嫦到y(tǒng)的臨床、基礎(chǔ)研究，既往課題組一系列的臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究[1-5]，已發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了補(bǔ)虛化瘀復(fù)方及其拆方補(bǔ)虛益氣生肌中藥能夠多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)地發(fā)揮作用，提高機(jī)體修復(fù)能力，有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究在此基礎(chǔ)上，以“補(bǔ)虛生肌”治療原則為指導(dǎo)，采用補(bǔ)虛中藥黃芪有效成分提取液，擬從Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通路及表皮干細(xì)胞的角度，探討其修復(fù)糖尿病潰瘍創(chuàng)面的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)，為中醫(yī)“肌平皮長(zhǎng)”理論提供客觀依據(jù)，為中醫(yī)藥促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合提供新的治療靶點(diǎn)，為臨床治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

雄性 SPF 級(jí) Wistar 大鼠 192 只，8 周齡，體質(zhì)量160-205 g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，許可證號(hào)：SYXK（滬）2014-0008，實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)經(jīng)過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)：PZSHUTCM19011113。

1.1.2 藥物

黃芪注射液10 ml/支（正大青春寶藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z3302017）。根據(jù)文獻(xiàn)[6]計(jì)算出人鼠等效劑量，以每支注射液相當(dāng)于原藥材20 g 得出觀察組用藥劑量。觀察組黃芪低劑量組、中劑量組、高劑量組生黃芪用藥分別為15 g、30 g、60 g，人鼠等效劑量分別為1.35 g·kg-1、2.7 g·kg-1、5.4 g·kg-1，用 藥 劑 量 分 別 為0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml。

1.1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（批號(hào)：S0130，美國(guó)sigma 公司）；兔抗增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）單克隆抗體（批號(hào)：13110）、兔抗β1整合素單克隆抗體（批號(hào)：34941）（均為CST 公司）；兔抗角蛋白19（Keratin19，K19）多克隆抗體（批號(hào)：1910712-1-AP）、小鼠抗細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）單克隆抗體（批號(hào)：160186-1-Ig）、兔抗β-連環(huán)素（β-Catenin）多克隆抗體（批號(hào)：51067-2-AP）、兔抗糖原合成激酶-3β（GSK-3β）多克隆抗體（批號(hào)：22104-1-AP），鼠抗GADPH 單克隆抗體（批號(hào)：60004-1-Ig）（均為Proteintech 公司）；兔抗 C-myc 單克隆抗體（批號(hào)：ab32072）、兔抗HistoneH3 多克隆抗體（批號(hào)：Ab1971）（均為Abcam 公司）；蛋白Marker（批號(hào)：26616，Thermo Fisher Scientific）；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：abs920，愛(ài)必信生物科技有限公司）；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（批號(hào)：P0028，Beyotime 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)：PICPI23223，thermo 公司）；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號(hào)：G2003，谷歌生物）；Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0006，碧云天公司）；cDNA 合成試劑盒（批號(hào)：11123ES60）、RealTime-PCR 試劑盒（批號(hào)：11123ES60）（均為上海翊圣公司）；血糖儀（穩(wěn)豪倍易型，美國(guó)強(qiáng)生公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：RT-6100，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；電泳儀（型號(hào)：1658003，bio-rad 公司）；多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiScope6000 Pro，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；PCR 儀（型號(hào)：ABI7500，ABI公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（32 只）和造模組（160）只。造模組大鼠在禁食12 h后，給予由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH4.2、0.1 mol·L-1）配制成 1% STZ 溶液，以質(zhì)量為 60 mg·kg-1單次腹腔內(nèi)注射，對(duì)照組腹腔注射等容積的0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉溶液。造模后第2 天、第7 天，尾靜脈取血測(cè)定空腹血糖，血糖 2 次均＞16.7 mmol·L-1，即成糖尿病大鼠模型[7-8]。每周檢測(cè)大鼠血糖1 次，飼養(yǎng)8 周后，大鼠異氟烷吸入麻醉，后背部剃毛，用直徑20 mm 的塑料瓶蓋在造模區(qū)（背部靠近腰椎一側(cè)）標(biāo)記，在無(wú)菌條件下，以外科方法作深達(dá)深筋膜、直徑為20 mm的全層皮膚缺損，形成糖尿病大鼠全層皮膚缺損開(kāi)放性創(chuàng)面模型。糖尿病造模組再隨機(jī)分為模型組、黃芪注射液低劑量組（低劑量組）、黃芪注射液中劑量組（中劑量組）、黃芪注射液高劑量組（高劑量組），各40只。

1.2.2 給藥和取材

各組于造模后次日開(kāi)始經(jīng)口灌胃給藥，低、中、高劑量三組予以黃芪提取液灌胃，劑量分別為0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml，1 次/d，正常對(duì)照組、模型組給予生理鹽水灌胃，每次 2 ml，1 次/d，分別于造模后第 7 天、第14 天、第21 天取材。大鼠創(chuàng)面換藥均以常規(guī)清潔，外敷生理鹽水紗布，加蓋消毒干紗布，用膠布固定。

每組隨機(jī)選取10只大鼠觀察創(chuàng)面基本情況，測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，觀察至創(chuàng)面愈合結(jié)束，統(tǒng)計(jì)創(chuàng)面愈合時(shí)間。在造模后第7 天、第14 天、第21 天每組分別隨機(jī)取選取6 只大鼠，采集包含創(chuàng)面內(nèi)組織及創(chuàng)周皮膚組織并處死大鼠。創(chuàng)面組織部分于-80℃冰箱凍存，用于 RealTime-PCR 及 WesternBlot 檢測(cè)，部分用于免疫組化染色。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1 創(chuàng)面愈合情況

用藥后測(cè)量創(chuàng)面面積，使用標(biāo)尺作為標(biāo)準(zhǔn)，固定高度垂直創(chuàng)面使用數(shù)碼相機(jī)拍照，使用Image pro plus 6.0 軟件描畫(huà)創(chuàng)面輪廓，經(jīng)軟件分析轉(zhuǎn)換為面積，得出原始創(chuàng)面面積，每組大鼠分別于造模當(dāng)天、造模后第3天、第7天、第14天、第21天用此方法拍照記錄創(chuàng)面面積，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。計(jì)算創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。各組均觀察至創(chuàng)面愈合結(jié)束，計(jì)算創(chuàng)面愈合時(shí)間。

1.2.3.2 RealTime-PCR 檢測(cè)

給藥后第7、14、21 天各組創(chuàng)面組織Wnt1、Wnt3a、β-連環(huán)素（β-Catenin）、糖原合成激酶3β（GSK-3β）mRNA 表達(dá)。按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和純度。Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β、β-actin 的 PCR 引物由上?；粕锘瘜W(xué)有限公司設(shè)計(jì)合成，Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β 基因 ID 號(hào)分別為：24881、303181、84353、84027，引物序列見(jiàn)表1。運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA 原液。隨后配制qReal-time PCR 反應(yīng)體系，以SYBRGreen 法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min（預(yù)變性），之后95℃ 10 s（變性），55℃ 20 s（退火），85℃ 20 s（延伸），40 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增完畢。根據(jù)Real-time PCR 原始檢測(cè)結(jié)果，按照 2－ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式，計(jì)算各樣品組織中Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3.3 Western Blot檢測(cè)

采用 Western Blot 檢測(cè)給藥后第 7、14、21 天各組創(chuàng)面組織β-Catenin、GSK-3β、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、C-myc 蛋白表達(dá)及β-Catenin 核內(nèi)表達(dá)水平。稱取創(chuàng)面組織剪碎研磨后，采用RIPA 裂解液提取組織總蛋白，采用組織勻漿液提取核蛋白，取上清液以BCA 法測(cè)定蛋白濃度，而后蛋白樣品在95℃變性10 min。各取樣品5 μl行SDS-PAGE 電泳分離并轉(zhuǎn)至NC膜，在含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加入β-Catenin、GSK-3β、CyclinD1、C-myc、GADPH、Histone H3 一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日將膜拿出在TBST 緩沖液中漂洗3 次/5 min，加入二抗溶液，37℃孵育2 h，TBST洗膜后，取出NC 膜，根據(jù)ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，顯色、定影，凝膠成像系統(tǒng)成像，其中核蛋白轉(zhuǎn)膜需要使用PVDF膜，分別以GADPH蛋白、Histone H3蛋白作為內(nèi)參，結(jié)果以各組β-Catenin、GSK-3β、C-myc、CyclinD1、β-Catenin入核電泳條帶灰度值比值表示。

表1 PCR引物序列

1.2.3.4 免疫組化法檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)給藥后第7、14、21天各組創(chuàng)面組織角蛋白19（Keratin 19，K19）、β1整合素、增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）表達(dá)。皮膚組織制成切片，再經(jīng)脫蠟、水化、修復(fù)后，加一抗（β1整合素：1：100，PCNA：1：3000，keratin 19：1：500），4℃過(guò)夜，洗滌后加二抗，37℃孵育50 min，添加DAB工作液，濕盒孵育40 s，蘇木素復(fù)染，無(wú)水酒精分化、脫水、透明化，封片。顯微鏡觀察，利用Image pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行測(cè)量分析，計(jì)算K19、β1整合素、PCNA陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的平均光密度值（Average Optical Density，AOD）。

1.2.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來(lái)表示，檢驗(yàn)方差齊性，方差齊者采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪提取液對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合率的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組在給藥后第3天、7天、14 天、21 天時(shí)的創(chuàng)面愈合率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組給藥后第14、21 天時(shí)創(chuàng)面愈合率顯著提高（P＜0.01），中劑量組則僅在給藥后第14天創(chuàng)面愈合率明顯提高（P＜0.05），低劑量組在這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率差異不明顯無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低、中、高各劑量組之間比較，高劑量組給藥后第14天創(chuàng)面愈合率高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。創(chuàng)面愈合情況見(jiàn)圖1，表2。

2.2 黃芪提取液對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）；與模型組比較，僅高劑量組創(chuàng)面愈合時(shí)間少于模型組（P＜0.05），余各組差異不明顯無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況

表2 黃芪提取液對(duì)不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的影響（%）

2.3 黃芪提取液對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面組織Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組創(chuàng)面組織Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA 的表達(dá)在創(chuàng)面造模后第 7、14、21 天時(shí)均明顯降低（P＜0.01），GSK-3β mRNA 表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組創(chuàng)面組織 Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA 的表達(dá)在給藥后第7、14、21 天時(shí)增加（P＜0.05），GSK-3β mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表3 黃芪提取液對(duì)創(chuàng)面愈合時(shí)間的影響（d）

2.4 黃芪提取液對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面組織β-Catenin、GSK-3β、CyclinD1、C-myc 及 β-Catenin 核內(nèi)表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組創(chuàng)面組織β-Catenin、CyclinD1蛋白表達(dá)在創(chuàng)面造模后第7、14、21天時(shí)均明顯降低（P＜0.01），GSK-3β的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組創(chuàng)面組織β-Catenin、C-myc、CyclinD1 蛋白表達(dá)在給藥后第7、14、21 天時(shí)增加（P＜0.05），GSK-3β表達(dá)降低（P＜0.05），高劑量組創(chuàng)面組織β-Catenin入核蛋白表達(dá)在給藥后第7、14天時(shí)明顯增加（P＜0.01）；各劑量組之間比較，高劑量組創(chuàng)面組織β-Catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表達(dá)在給藥后第7、14、21天時(shí)明顯高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而GSK-3β表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表5、表6和圖2。

表4 黃芪提取液對(duì)創(chuàng)面組織Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA表達(dá)的影響（n=6）

2.5 黃芪提取液對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面組織K19、β1整合素、PCNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組創(chuàng)面組織K19、β1 整合素、PCNA表達(dá)在創(chuàng)面造模后第7、14、21天時(shí)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，中、高劑量組創(chuàng)面組織K19、β1 整合素、PCNA 的表達(dá)在給藥后第 7、14、21 天時(shí)明顯增加（P＜0.01）；各劑量組之間比較，高劑量組K19、β1 整合素、PCNA 表達(dá)在給藥后第 7、14、21 天時(shí)明顯高于低劑量組（P＜0.01）。見(jiàn)表7、圖3。

表5 黃芪提取液對(duì)創(chuàng)面組織β-Catenin、GSK-3β、C-myc、CyclinD1蛋白表達(dá)的影響（n=6）

表6 黃芪提取液對(duì)創(chuàng)面組織β-Catenin核內(nèi)表達(dá)的影響（n=6）

3 討論

表7 黃芪提取液對(duì)創(chuàng)面組織K19、β1整合素、PCNA表達(dá)的影響（n=6）

圖3 各組給藥后第14天K19、β1整合素、PCNA免疫組化染色（×400）

糖尿病潰瘍屬中醫(yī)“消渴”、“脫疽”“潰瘍”等范疇，中醫(yī)在治療糖尿病潰瘍方面有著悠久的歷史，且療效顯著，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了“腐祛肌生、肌平皮長(zhǎng)”的潰瘍愈合規(guī)律。顧氏外科第四代傳人外科名家唐漢鈞教授治療糖尿病性潰瘍主張“補(bǔ)虛生肌”、“化瘀生肌”理論，認(rèn)為正氣虛損，正氣不足是發(fā)病之本，潰瘍難以愈合的根本原因。依據(jù)《素問(wèn)》“治病必求其本”、“虛者補(bǔ)之、損者益之”的理論，確立補(bǔ)虛生肌的治療法則。中藥黃芪味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，甘能益氣，溫能補(bǔ)虛，有補(bǔ)益脾肺、益氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、托瘡生肌的功效，被譽(yù)為“瘡家之圣藥”。黃芪長(zhǎng)于補(bǔ)脾肺之氣，中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)“脾主肌肉”、“肺主皮毛”，脾為氣血生化之源，全身肌肉都依靠脾胃運(yùn)化的水谷精微化生氣血來(lái)營(yíng)養(yǎng)，脾旺則正氣足，氣血生化充足，肌肉得以濡潤(rùn)而豐滿；肺輸布津液，宣發(fā)衛(wèi)氣外達(dá)皮毛，充養(yǎng)皮膚，瘡面更易愈合。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究[9]證明，黃芪的有效成分主要為黃芪皂苷、黃芪多糖、黃芪總酮等，在改善局部微循環(huán)、促進(jìn)成纖維細(xì)胞、合成膠原蛋白、修復(fù)角質(zhì)形成細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等方面起著一定的作用[10]。黃芪注射液由先進(jìn)工藝從中藥黃芪中提取有效成分精制而成，皂苷類、黃酮類、多糖類為其功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[11]，相較于傳統(tǒng)水煎有效成分穩(wěn)定，雜質(zhì)較少，且已在臨床上廣泛應(yīng)用，基于相關(guān)臨床研究[12-13]表明，黃芪注射液可顯著調(diào)節(jié)糖尿病皮膚潰瘍患者炎癥細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激物水平促進(jìn)創(chuàng)面愈合，還能縮短傷口愈合時(shí)間，減輕不適癥狀。因而，本實(shí)驗(yàn)選取此中成藥試劑進(jìn)行灌胃藥物干預(yù)，旨在揭示黃芪促進(jìn)上皮化，加速糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病模型組大鼠創(chuàng)面愈合緩慢，在創(chuàng)面造模后的第3、7、14、21 天創(chuàng)面愈合率明顯低于正常對(duì)照組大鼠，且創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯延長(zhǎng)，而黃芪藥物干預(yù)組創(chuàng)面愈合率較模型組得到改善，尤其是高劑量組在給藥第14、21天差異更為明顯，這表明黃芪提取液能有效促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合，尤其在創(chuàng)面修復(fù)增殖階段效果顯著，且與劑量依賴有一定關(guān)系。

糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合涉及局部炎癥反應(yīng)、增殖階段和組織塑形重建這3個(gè)密切聯(lián)系、交互重疊的階段，其中增殖階段的血管新生、肉芽形成、上皮化是創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。已有研究[15]表明，糖尿病創(chuàng)面肉芽生成減少，再上皮化延遲或缺失，創(chuàng)面愈合緩慢。再上皮化障礙是糖尿病潰瘍創(chuàng)面難愈合的重要原因之一。表皮干細(xì)胞作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞，是皮膚組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞，主動(dòng)參與創(chuàng)面的修復(fù)，促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化，其位于皮膚的基底層，具有無(wú)限增殖和分化潛能，是創(chuàng)面再上皮化過(guò)程中各層表皮細(xì)胞的源細(xì)胞，表皮細(xì)胞的更新正是通過(guò)其向上增殖分化來(lái)完成[16-18]。已有研究[19]發(fā)現(xiàn)，糖尿病創(chuàng)面愈合過(guò)程中表皮干細(xì)胞呈現(xiàn)出數(shù)量少、活性低的動(dòng)態(tài)變化，影響上皮化過(guò)程，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲。K19 和β1整合素是目前公認(rèn)的表皮干細(xì)胞特異性相對(duì)較高的標(biāo)記物[20]，以K19 和β1 整合素同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)來(lái)鑒別創(chuàng)周表皮干細(xì)胞。PCNA 是用作評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞生長(zhǎng)速度和狀態(tài)[21]。

Wnt 通路是由Wnt 蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白等組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究[22]認(rèn)為其參與創(chuàng)面愈合的過(guò)程，發(fā)揮著調(diào)控皮膚及其附屬器的發(fā)育、促進(jìn)創(chuàng)面血管新生及上皮重塑的功能。Wnt/β-Catenin 通路是經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路，機(jī)制較為清晰與表皮干細(xì)胞增殖分化關(guān)系密切。通常情況下，Wnt/β-Catenin轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)中啟動(dòng)信號(hào)蛋白Wnt 蛋白處于靜息狀態(tài)，皮膚損傷時(shí)，Wnt蛋白通過(guò)自分泌或旁分泌作用與位于細(xì)胞膜的相關(guān)受體結(jié)合，降低GSK3β 的活性，抑制β-Catenin 的磷酸化,，使β-Catenin 在胞內(nèi)集聚，最后游離β-Catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與T 細(xì)胞因子（TCF）/淋巴細(xì)胞因子（LEF）結(jié)合，激活信號(hào)通路，啟動(dòng)靶基因C-myc、CyclinD1 等的表達(dá)[23]。該經(jīng)典通路的標(biāo)志即是β-Catenin 的積累，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移[24]。β-Catenin 是 Wnt經(jīng)典信號(hào)通路中的核心關(guān)鍵，其在胞質(zhì)中的含量高低直接影響著核內(nèi)靶基因的表達(dá)，對(duì)表皮干細(xì)胞增殖分化起一定作用[25]。有研究[26-27]表明，Wnt 及 β-Catenin 表達(dá)增強(qiáng)，表皮細(xì)胞增殖、分化能力加強(qiáng)，創(chuàng)面愈合速度加快。而已知的Wnt 蛋白家族成員中，能激活經(jīng)典通路的有 Wnt1、Wnt3a[28]，GSK3β 是決定降解復(fù)合體中β-Catenin磷酸化的重要激酶，起著關(guān)鍵性的負(fù)向調(diào)節(jié)作用[29-30]。

本實(shí)驗(yàn)在糖尿病潰瘍大鼠模型證實(shí)，在創(chuàng)面造模后第7、14、21 天，β-Catenin 在糖尿病大鼠創(chuàng)面組織中呈低表達(dá)，GSK-3β 蛋白表達(dá)增加，CyclinD1、C-myc 蛋白表達(dá)下降，β1 整合素、K19、PCNA 表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少，從而進(jìn)一步表示W(wǎng)nt/β-Catenin 信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)，創(chuàng)面表皮干細(xì)胞數(shù)量少，增殖能力減弱，這與以往的實(shí)驗(yàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[21]。在通過(guò)黃芪注射液給藥之后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量組大鼠創(chuàng)面組織在給藥第 7、14、21 天 Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA水平較模型組明顯上升，GSK-3β mRNA 水平下降，β-Catenin 與β-Catenin 核內(nèi)表達(dá)水平增加，GSK-3β 蛋白表達(dá)下降，下游靶基因C-myc、CyclinD1蛋白的表達(dá)較模型組上升，由此說(shuō)明Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路活化，β-Catenin 入核激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，K19、β1整合素、PCNA 陽(yáng)性表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明促進(jìn)了表皮干細(xì)胞的增殖分化，這也是高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組，創(chuàng)面愈合時(shí)間縮短的內(nèi)在機(jī)制。綜上所述，本研究表明黃芪提取液與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路活化有關(guān)，通過(guò)對(duì)Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK3β 的調(diào)控，上調(diào)β-Catenin、C-myc、CyclinD1 等蛋白起到調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路的作用，從而影響表皮干細(xì)胞的增殖分化，加快創(chuàng)面上皮化的進(jìn)程，加速糖尿病潰瘍的愈合。本研究揭示了中藥黃芪促進(jìn)上皮化，加速創(chuàng)面愈合的機(jī)制，為糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的治療提供新思路。