劉博男，宋 輝，薛 屹，孫向明，胡 揚(yáng)，李文蘭＊＊

（1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心 哈爾濱 150076）

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是一種以骨密度及骨量下降、骨組織的微結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度損害，造成患者骨脆性增加，易于發(fā)生骨折為特征的疾病，病癥以老年人和絕經(jīng)后婦女為主要發(fā)病人群，主要表現(xiàn)有駝背、腰背疼痛、骨折乃至呼吸功能下降[1]。近年來(lái)，伴隨我國(guó)老齡化加劇，老齡人口數(shù)目增加，該病癥備受關(guān)注。且由于女性絕經(jīng)后卵巢功能下降，體內(nèi)雌激素水平顯著下降，絕經(jīng)時(shí)間和體質(zhì)量指數(shù)是影響骨質(zhì)疏松癥的最重要的相關(guān)因素，因此絕經(jīng)后婦女易發(fā)生骨質(zhì)疏松[2]。目前，雌激素受體α（ERα）仍是預(yù)防絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的首選靶標(biāo)[3-4]。因此，充分認(rèn)識(shí)骨質(zhì)疏松，了解其發(fā)病機(jī)制，做到有效預(yù)防、及時(shí)準(zhǔn)確治療，對(duì)緩解骨質(zhì)疏松意義重大。

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子（CuscutaaustralisR. Br.）或菟絲子（Cuscuta chinensisLam.)的干燥成熟種子。近年藥理研究[5]發(fā)現(xiàn)菟絲子對(duì)生殖系統(tǒng)、骨代謝、免疫系統(tǒng)等多方面均有良好的藥理活性，且其具有清除自由基和抗氧化的作用。據(jù)文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道，菟絲子在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的臨床應(yīng)用方面均有明顯療效。臨床上菟絲子也是常見(jiàn)的用于防治骨質(zhì)疏松的中藥，在眾多防治骨質(zhì)疏松的復(fù)方中均有菟絲子的應(yīng)用，右歸丸中菟絲子在養(yǎng)肝的同時(shí)兼顧補(bǔ)腎，對(duì)降低原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者骨折發(fā)生率有顯著療效[9]；聯(lián)合鈣片使用后血清中骨鈣蛋白（BGP）的活性增高，且25-OHD3、IGF-I 水平得以改善[10]，因此闡明菟絲子治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制也可為今后合理用藥、聯(lián)合用藥提供參考依據(jù)。

中藥研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一是理解中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證生物系統(tǒng)間的作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以多向系統(tǒng)藥理學(xué)與生物學(xué)為基礎(chǔ)提出來(lái)一種的藥物研究新方法，通過(guò)建立網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)將病證、藥物映射于生物分子網(wǎng)絡(luò)，然后通過(guò)軟件及專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)病證與藥物的關(guān)系進(jìn)行計(jì)算、分析與預(yù)測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制[11-12]。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過(guò)篩選中藥成分，預(yù)測(cè)有效成分發(fā)揮作用的靶蛋白，分析靶蛋白涉及的信號(hào)通路來(lái)探討中藥治療疾病的機(jī)制[13]。本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)菟絲子參與治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制，對(duì)菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的有效成分及對(duì)應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行歸納整理，總結(jié)出菟絲子“活性成分-靶標(biāo)-通路”三者之間的聯(lián)系，為探索菟絲子可能的預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分的獲取與活性成分的篩選

從 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“菟絲子”或“cuscuta”為關(guān)鍵詞，搜索有關(guān)菟絲子所含所有化學(xué)成分的信息[14]，并綜合篩選活性成分，網(wǎng)址詳見(jiàn)表1。同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)篩選后的成分進(jìn)行補(bǔ)充，通過(guò)查閱文獻(xiàn)得到菟絲子與治療骨質(zhì)疏松高度相關(guān)的化合物，對(duì)篩選后的成分進(jìn)行補(bǔ)充，最終確定菟絲子發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分。

1.2 菟絲子活性成分作用靶標(biāo)及骨質(zhì)疏松癥靶標(biāo)的獲取

使用 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)復(fù)制并下載化合物靶標(biāo)信息，獲得中藥菟絲子活性成分的靶蛋白，篩選有效成分靶標(biāo)。利用GeneCards、OMIM[15]數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索關(guān)鍵詞 Osteoporosis，篩選并導(dǎo)出疾病相關(guān)靶標(biāo)[16]，整理在數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的與骨質(zhì)疏松相關(guān)的靶標(biāo)，刪除重復(fù)靶標(biāo)并篩選出菟絲子活性成分與骨質(zhì)疏松的共同靶標(biāo)，為后期構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治鲎鰷?zhǔn)備。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)

1.3 “活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“1.1”項(xiàng)得到的菟絲子的活性成分和“1.2”項(xiàng)收集的菟絲子活性成分相對(duì)應(yīng)的治療骨質(zhì)疏松癥的靶標(biāo)導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.6.0，構(gòu)建菟絲子的“活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中“節(jié)點(diǎn)”（node）表示中藥所含活性成分及作用靶標(biāo)，“邊”（edge）表示活性成分與靶標(biāo)間的關(guān)系。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

基因或蛋白并不是孤立地發(fā)揮作用，通常情況下是與多個(gè)基因或蛋白相互影響，這種基因或蛋白之間相互作用構(gòu)成了PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用[17]。將“1.2”項(xiàng)菟絲子的蛋白靶標(biāo)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo Sapiens”即人類，設(shè)置隱藏游離靶標(biāo)，設(shè)定蛋白相互作用分值為0.4，獲取相應(yīng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的關(guān)系。

1.5 菟絲子作用于骨質(zhì)疏松癥的GO 富集分析和KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入“1.2”項(xiàng)中得到靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，靶基因名修正為“official gene symbol”，列出得到作用靶標(biāo)的GO 富集分析及KEGG 通路富集分析，篩選出與骨質(zhì)疏松疾病相關(guān)的生物過(guò)程及通路進(jìn)行深入分析。

2 結(jié)果

2.1 菟絲子活性成分分析

搜索 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)，收集到菟絲子的活性成分，參考藥代動(dòng)力學(xué)ADME 參數(shù)，以口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選同時(shí)符合上述條件的活性成分，從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出符合條件的活性成分11 個(gè)，包括芝麻素、異鼠李素、β-谷甾醇、苦參堿、槲皮素等，此外通過(guò)查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充得到菟絲子與治療骨質(zhì)疏松高度相關(guān)的化合物3 個(gè)：芹菜素、金絲桃苷、紫云英苷[18-21]。將這14個(gè)成分確定為菟絲子發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分（表2）。

表2 菟絲子主要活性成分基本信息

2.2 潛在靶標(biāo)預(yù)測(cè)

在 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索菟絲子活性成分的潛在靶標(biāo)，去除重復(fù)靶標(biāo)后，共得到126 個(gè)潛在靶標(biāo)，GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶標(biāo)共3 126個(gè)。將活性成分對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)與GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中與骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標(biāo)的比較，篩選出菟絲子治療骨質(zhì)疏松的83個(gè)潛在作用靶標(biāo)（圖1）。

2.3 “活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖1 藥物-疾病靶標(biāo)Venn分析圖

將菟絲子活性成分和靶標(biāo)的相互作用關(guān)系等信息輸入Cytoscape 3.6.0 軟件中，構(gòu)建菟絲子“活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，由圖2 可知，活性成分-靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)中包含活性成分節(jié)點(diǎn)14 個(gè)，靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)83 個(gè)，節(jié)點(diǎn)間相互作用關(guān)系的邊231條。

2.4 靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系，設(shè)置中選擇隱藏游離點(diǎn)，選擇相關(guān)作用分?jǐn)?shù)為0.4，下載TSV 格式，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件中構(gòu)建靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.6.0 繪制蛋白相互作用的圖形，由圖3可知，經(jīng)過(guò)篩選得到靶標(biāo)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)81 個(gè)，邊814 條。結(jié)合現(xiàn)有的研究結(jié)果，推測(cè)菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥可能與白細(xì)胞介素-6（IL-6）、胰島素（INS）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、骨分化特異性轉(zhuǎn)錄分子2（RUNX2）、雌激素受體α（ESR1）等靶標(biāo)有關(guān)。

2.5 菟絲子作用于骨質(zhì)疏松癥的GO 功能分析及KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)后，得到GO功能分析表明：83個(gè)藥物-疾病交集靶標(biāo)影響了82 個(gè)生物學(xué)過(guò)程（P＜0.05），選取最為顯著的20 個(gè)生物學(xué)過(guò)程繪制GO 功能分析圖，見(jiàn)圖4；菟絲子通過(guò)改變DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA 聚合酶II 特異性、輔因子結(jié)合、核受體活性等發(fā)揮藥效。KEGG 富集分析得到91 條通路(P＜0.05)，根據(jù)KEGG 富集分析及結(jié)合現(xiàn)有研究結(jié)果（圖5）：PI3K/Akt 信號(hào)通路（PI3K/Akt signaling pathway）；腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）；MAPK 信號(hào)通路；Wnt 信號(hào)通路；胰島素拮抗信號(hào)通路（Insulin resistance signaling pathway）等通路與菟絲子治療骨質(zhì)疏松的潛在靶標(biāo)密切相關(guān)，表明菟絲子可能通過(guò)多條通路作用于骨質(zhì)疏松發(fā)揮其藥效。

圖2 活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 菟絲子潛在靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO功能分析

圖5 KEGG富集分析圖

3 討論

3.1 菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥的意義

伴隨我國(guó)人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松患者人數(shù)逐年遞增。且該病常呈現(xiàn)漸進(jìn)性、隱蔽性，患病后致殘率、致死率均較高，因此是危害中老年人健康的重大疾病[22]。古人通過(guò)長(zhǎng)期的中藥應(yīng)用實(shí)踐，總結(jié)出“腎主骨、生髓”的中醫(yī)理論，將補(bǔ)腎藥用于骨科疾病的治療；中醫(yī)理論認(rèn)為，腎為先天之本，骨骼的生長(zhǎng)、發(fā)育及衰弱與腎精盛衰緊密相關(guān)，骨質(zhì)疏松癥在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中為腎虛導(dǎo)致，因此中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松以補(bǔ)腎為主[23-24]。菟絲子作為補(bǔ)益肝腎的中藥對(duì)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、改善卵巢早衰、保肝明目等方面有著顯著的藥理活性[25-26]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論基礎(chǔ)，借助有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及繪圖軟件等工具對(duì)中藥菟絲子治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

3.2 主要成分分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，菟絲子防治骨質(zhì)疏松的成分有：槲皮素、山奈酚、金絲桃苷、異鼠李素等14 種成分。研究[27]表明槲皮素可通過(guò)抑制細(xì)胞衰老進(jìn)而減少因雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨流失，成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一種方法。還可以通過(guò)促進(jìn)骨分化改善骨質(zhì)疏松癥[28]；山奈酚的作用機(jī)制可能與抑制骨吸收有關(guān)[29]；金絲桃苷可通過(guò) BMP 和 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路共同促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及分化[19]。異鼠李素防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制則是通過(guò)調(diào)控RANKL/RANK/OPG 信號(hào)通路，同時(shí)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能，改善骨微結(jié)構(gòu)上的破壞，實(shí)現(xiàn)防治骨質(zhì)疏松癥[30]。由此可見(jiàn)菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分是通過(guò)不同作用機(jī)制生效。

3.3 主要靶標(biāo)分析

菟絲子和骨質(zhì)疏松的交集靶基因共83個(gè)，與疾病顯著相關(guān)的靶標(biāo)有IL-6、骨分化特異性轉(zhuǎn)錄分子2（Runx2）、VEGFA 等，經(jīng)過(guò)GO 功能分析出菟絲子治療骨質(zhì)疏松的生物學(xué)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA 聚合酶II 特異性、輔因子結(jié)合、核受體活性等。其中IL-6 可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性[31]。Runx2 作為成骨分化過(guò)程中一個(gè)必要的轉(zhuǎn)錄因子，適量的Runx2 能提高PI3K 信號(hào)通路的活性[32]，VEGF 則可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成，加速骨形成及重建過(guò)程，通過(guò)增加成骨細(xì)胞的成骨活性，降低破骨細(xì)胞溶骨活性來(lái)促進(jìn)骨形成及增加骨密度[33]。菟絲子活性成分通過(guò)調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)起到有效防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

3.4 主要通路分析

經(jīng)KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)了91 條通路（P≤0.05），與菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)通路有PI3K/Akt、MAPK、Wnt等。研究[34]表明PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、黏附以及細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用；PI3K/Akt 信號(hào)通路能刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，也可以抑制成骨細(xì)胞凋亡[35]。激活PI3K/Akt 信號(hào)通路可使下游關(guān)鍵性控制凋亡的因子如：FoxO1、Bad、Caspase-9、和 GSK-3β 磷酸化，從而起到抗凋亡的作用[36-37]。PI3K/Akt 和 BMP 通路、Runx2、FoxO 信號(hào)通路也有著緊密聯(lián)系，骨形成蛋白(BMPS)作為重要的自分泌和旁分泌生長(zhǎng)因子，由成骨細(xì)胞合成并釋放，在骨形成和骨骼修復(fù)過(guò)程中起著不可替代的作用[38]。MAPK信號(hào)通路在成骨細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，研究[39-40]證實(shí)MAPK 通過(guò)作用于成骨細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)骨形成，激活p38/MAPK 可增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和增加骨量[41]。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在防治骨質(zhì)疏松癥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，軟骨細(xì)胞的增殖及分化，軟骨內(nèi)骨化，骨痂的吸收、重塑和改建等過(guò)程離不開(kāi)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的參與，這些過(guò)程可通過(guò)上調(diào)Runx2 實(shí)現(xiàn)[32,42]。菟絲子黃酮能調(diào)節(jié)去卵巢大鼠Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)因子β-catenin、OPG、RANKL、DKK1 的水平，從而增加骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥狀[43]。KEGG 結(jié)果表明治療骨質(zhì)疏松的相關(guān)信號(hào)通路在一定程度上與其他信號(hào)通路間存在多種多樣的相互作用關(guān)系，提示治療骨質(zhì)疏松時(shí)應(yīng)在針對(duì)局部關(guān)鍵通路的基礎(chǔ)上，還需針對(duì)疾病產(chǎn)生的原因、疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)、機(jī)體所處環(huán)境，進(jìn)行多系統(tǒng)干預(yù)，這也體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病時(shí)追求的治病求本、標(biāo)本兼治的特色，進(jìn)一步證明中藥可對(duì)多個(gè)靶標(biāo)、多項(xiàng)通路進(jìn)行綜合干預(yù)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了中藥菟絲子預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果表明中藥菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分可能有槲皮素、山奈酚、金絲桃苷、異鼠李素等，這些有效成分通過(guò)調(diào)控IL-6、Runx2、VEGFA、ESR1等靶點(diǎn)控制PI3K/Akt、MAPK、Wnt 等信號(hào)通路發(fā)揮藥效。確定了菟絲子治療骨質(zhì)疏松的直接和間接調(diào)控靶標(biāo)，以“有效成分-疾病靶標(biāo)”為基礎(chǔ)分析出其可能的作用機(jī)制。為后續(xù)機(jī)制的探討和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化等提供了重要的理論基礎(chǔ)。本文也為相關(guān)作用機(jī)制的研究提供了思路和方法，尤其是分析中藥針對(duì)某種特定疾病的作用機(jī)制，說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有科學(xué)性和指導(dǎo)性，為后續(xù)深入探討菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制提供了依據(jù)。同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也存在局限性：無(wú)法解決藥物代謝動(dòng)力學(xué)、時(shí)辰藥理學(xué)等過(guò)程中可能發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化，因此部分預(yù)測(cè)結(jié)果及作用機(jī)制還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察證實(shí)，從而完善中藥治療疾病相關(guān)機(jī)制的研究。本課題組接下來(lái)將考察菟絲子對(duì)關(guān)鍵蛋白及基因的調(diào)控，深入揭示菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，旨在為菟絲子防治骨質(zhì)疏松類新藥的機(jī)制研究及開(kāi)發(fā)利用提供參考。