姬夢姣，朱博冉，魏亞男，張文苑，翟 意，陶偉偉，吳顥昕

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 中醫(yī)腦病重點實驗室 南京 210023）

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）主要是脂質(zhì)代謝異常，其病理表現(xiàn)主要與血漿或血清中的總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）水平升高和（或）高密度蛋白-膽固醇（HDL-C）水平降低有關(guān)，可導(dǎo)致多種并發(fā)癥的產(chǎn)生，如動脈粥樣硬化、糖尿病、阿爾茲海默癥和帕金森病等[1-2]。中醫(yī)學(xué)高脂血癥與“肥胖”“中風(fēng)”“血瘀”“痰濁”“血濁”等病類似，其發(fā)病因素涉及多種方面，飲食、情緒、勞倦均與之相關(guān)[3]；病機方面，高脂血癥為本虛標(biāo)實之證，以正虛為本、痰瘀為標(biāo)[4]。

中醫(yī)治療高脂血癥針對正虛、痰濕、瘀血主要以益氣活血化瘀中藥治療。補陽還五湯（Buyang Huanwu decoction）出自清代醫(yī)家王清仁《醫(yī)林改錯》，是益氣活血的代表方，由7味中藥（黃芪、赤芍、歸尾、川芎、地龍、桃仁和紅花）組成，本方以補氣為主，活血祛瘀為輔，共奏補氣活血化瘀之功效，主要用于氣虛血瘀之癥[5]。現(xiàn)代研究表明，補陽還五湯具有降脂降糖、抗炎、抗缺氧、降壓、改善微循環(huán)以及抗血栓等作用，對治療高脂血癥、心血管疾病和糖尿病腎病等療效較佳[6-8]。臨床及實驗研究表明，補陽還五湯可顯著改善高脂血癥[9-12]。

由于中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性和靶點的不確定性，常規(guī)藥理研究方法難以全面闡明補陽還五湯治療高脂血癥的分子作用機制。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)性，從整體角度來探究補陽還五湯治療高脂血癥的作用機制，以期提供新的思路。

1 方法

1.1 補陽還五湯化學(xué)成分的獲取與篩選及靶點預(yù)測

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）對補陽還五湯成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進(jìn)行構(gòu)建，并對主要活性成分進(jìn)行篩選。根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫使用指南，將OB 值（生物利用度）的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為≥30%，DL 值（類藥性）≥0.18。因為TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未收錄“當(dāng)歸尾”“地龍”相關(guān)數(shù)據(jù)，所以根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》一部規(guī)范藥材名，將當(dāng)歸代替當(dāng)歸尾處理，并從TCMID 數(shù)據(jù)庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）中獲取“地龍”的化學(xué)成分。利用STICH 數(shù)據(jù)庫（http://stich.embl.de/）將以上獲得的潛在成分進(jìn)行靶點預(yù)測并利用UniProt KB 數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)對以上獲得的藥物成分靶點進(jìn)行規(guī)范命名。

1.2 高脂血癥疾病靶點獲取

通過人類表型數(shù)據(jù)庫HPO（https://hpo.jax.org/）檢索高脂血癥相關(guān)基因，并與成分靶點合并進(jìn)行下一步網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

將以上獲得的成分靶點和疾病靶點導(dǎo)入至STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）中，得到成分靶點和疾病靶點的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)關(guān)系，利用Cytoscape 3.6.1軟件建立可視化網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，了解蛋白與蛋白之間的聯(lián)系。在構(gòu)建補陽還五湯所含藥物的靶點與高脂血癥基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(hubs)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，以“節(jié)點連接度（degree）”“節(jié)點緊密度(closeness)”“節(jié)點介度(betweenness)”的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足三個卡值的節(jié)點作為補陽還五湯防治高脂血癥失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶點。本研究通過對上述藥物候選靶點所參與的通路進(jìn)行富集分析，進(jìn)一步挖掘補陽還五湯防治高脂血癥的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)分子機制，并構(gòu)建“補陽還五湯-化學(xué)成分-核心靶點-關(guān)鍵通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖。

1.4 KEGG通路分析

本研究采用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）對候選靶點進(jìn)行通路富集分析以闡明候選靶點蛋白在信號通路中的作用，并根據(jù)通路富集結(jié)果獲得相應(yīng)的P值，選擇P＜0.01 的排序前20 的通路，然后再利用R 語言將獲得的KEGG 通路制作成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分篩選與靶點預(yù)測

根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集補陽還五湯的化學(xué)成分，分別獲得各單味藥中的潛在活性成分，黃芪20 個，當(dāng)歸2個，赤芍29個，川芎7個，桃仁23個，紅花15個，從TCMID數(shù)據(jù)庫中獲得地龍的潛在活性成分7個。有些化合物，如黃芪甲苷（黃芪）、阿魏酸（當(dāng)歸）、藁本內(nèi)酯（當(dāng)歸）、苦杏仁苷（桃仁）、紅花黃色素（紅花）、亞油酸（當(dāng)歸）不符合篩選條件，但是根據(jù)2015 年版《中華人民共和國藥典》得知以上大多數(shù)成分屬于各中藥的指標(biāo)性成分，且阿魏酸和藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸與川芎所共有，亞油酸為當(dāng)歸、川芎、桃仁和紅花所共有，結(jié)合文獻(xiàn)搜索也發(fā)現(xiàn)這些成分對于高脂血癥有相關(guān)治療作用[13-14]，故將這6 個成分補充到成分篩選中，因此共得107 個潛在活性成分。通過查找文獻(xiàn)補充疾病相關(guān)化合物的方法參考了劉楠等[15]的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法。通過常規(guī)方法再加上手動查找2015年版《中華人民共和國藥典》以及文獻(xiàn)，能更加全面的反應(yīng)補陽還五湯化學(xué)成分防治高脂血癥的機制。

將以上獲得的107個潛在成分導(dǎo)入STICH 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測，去除無靶點者共獲得801個靶點，其中黃芪 202 個，當(dāng)歸 85 個，赤芍 138 個，川芎 112 個，桃仁67 個，紅花 138 個，地龍 59 個，具體信息見表 1。將以上獲得的補陽還五湯的潛在活性成分去掉重復(fù)成分后得到潛在活性成分共計100 個。有重復(fù)成分者如β-谷甾醇，阿魏酸，亞油酸等，將其按順序劃歸到最開始出現(xiàn)的中藥上，如β-谷甾醇劃歸為黃芪。故最終刪除重復(fù)成分的靶點后共獲得487 個靶點，用于下一步研究。

2.2 疾病靶點獲取

將高脂血癥（Hypwelipidemia）為關(guān)鍵詞輸入到人類表型數(shù)據(jù)庫HPO 中，設(shè)置搜索條件為HPO brower，選擇相關(guān)基因（associated genes）條目，得到關(guān)于高脂血癥的疾病靶點95個，并將其與成分靶點合并以進(jìn)行下一步網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析。

2.3 靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將成分靶點和疾病靶點合并導(dǎo)入至STRING 數(shù)據(jù)庫中，其中settings 項目下的minimum required interaction score 選擇 highest confidence(0.900)，得到成分靶點和疾病靶點的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)關(guān)系，再利用Cytoscape 3.6.1 軟件建立可視化網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，得到圖1A，然后根據(jù)“degree”“closeness”和“betweenness”條件篩選得到圖1B（圖中黃色部分為符合條件者），將符合條件的靶點篩選出得到圖1C。圖1 是篩選補陽還五湯治療高脂血癥核心靶點的整個過程。

表1 “中藥-成分-靶點”基本信息

結(jié)果顯示，核心靶點113個，其中治療高脂血癥的直接靶點19 個，潛在靶點94 個，篩選出的這些靶點組成補陽還五湯治療高脂血癥的潛在靶點網(wǎng)絡(luò)，將核心靶點整理得到圖2。如圖所示，節(jié)點的大小代表degree值的大小，degree值越大，說明這個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大。113個核心靶點中degree排序前20的靶點分別是CREB 結(jié)合蛋白（CREBBP）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、維甲酸受體RXR-alpha（RXRA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、轉(zhuǎn)錄因子 AP-1（JUN）、轉(zhuǎn)錄因 子 p65（RELA）、腫瘤壞死因子-α（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄亞基1 的介體（MED1）、白介素-6（IL6）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、白介素8（CXCL8）、載脂蛋白AI（APOA1）、核因子NF-κB p105亞基（NFKB1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC（SRC）、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP1）、載脂蛋白B（APOB）、胰島素（INS）。見表2。

圖1 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

圖2 補陽還五湯靶點-疾病靶點相互作用靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 degree值排名前20靶點

2.4 補陽還五湯治療高脂血癥的通路篩選

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對以上篩選出的113 個核心靶點進(jìn)行KEGG 通路富集，共獲得126 條通路，其中P＜0.05 的前 20 條通路通過 R 語言（R3.6.1，繪圖包ggplot2）進(jìn)行可視化處理，見圖3。其中氣泡面積大小代表基因數(shù)量，氣泡顏色代表P值的大小，即富集顯著性。篩選出的這20 條通路中與疾病相關(guān)通路有11條，分別是乙肝，癌癥通路，胰腺癌，癌癥中的蛋白多糖，前列腺癌，弓形體病，膀胱癌，丙肝，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，恰加斯?。涣硗? 條通路與代謝、炎癥、缺氧及其他方面相關(guān)，分別是HIF-1 信號通路，TNF 信號通路，脂肪細(xì)胞因子信號通路，PI3K-Akt 信號通路，F(xiàn)oxO 信號通路，甲狀腺激素信號通路，反轉(zhuǎn)錄內(nèi)源性大麻素信號，催乳素信號通路，γ-氨基丁酸能突觸。

2.5 補陽還五湯防治高脂血癥的“中藥-成分-靶點-通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖

整合以上綜合數(shù)據(jù)，利用Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)一步構(gòu)建“補陽還五湯-化學(xué)成分-核心靶點-關(guān)鍵通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。本研究結(jié)果顯示，補陽還五湯治療高脂血癥的作用主要與22 個化學(xué)成分以及作用于20 條主要作用通路的113 個核心靶點相關(guān)聯(lián)，這是該方發(fā)揮治療高脂血癥藥效的核心所在，也體現(xiàn)了多成分與多靶點之間共同作用的機制，符合中藥復(fù)方作用的特點。

圖3 補陽還五湯核心靶點參與的通路信息

3 分析與展望

3.1 補陽還五湯成分分析

通過“補陽還五湯-化學(xué)成分-核心靶點-關(guān)鍵通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖可知，補陽還五湯治療高脂血癥的有效成分有22個，其中有較多作用靶點的成分主要有亞油酸（24）、黃芩素（22）、槲皮素（21）和山奈酚（17）。Bruen等[16]研究證明，亞油酸可抗動脈粥樣硬化，主要通過抑制炎癥反應(yīng)、抑制泡沫細(xì)胞形成和調(diào)節(jié)循環(huán)膽固醇來發(fā)揮作用。黃芩素主要發(fā)揮抗氧化和抗炎活性，清除活性氧，并通過減弱NF-κB 的活性抑制多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子，可用于治療糖尿病，心血管疾病，炎性腸病等[17]。山奈酚和槲皮素有降糖降脂、抗炎、抗氧化、抗癌等作用[18]，山奈酚可以通過增加肝臟 PPARα 水平，下調(diào) SREBPs 并促進(jìn) ACO 和CYP4A1 的肝表達(dá)來增加脂質(zhì)代謝，從而減少高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪的積累并改善高脂血癥[19]。槲皮素通過上調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（例如ABCA1 和ABCG1）以及通過減少氧化來提高HDL 和APOA1的膽固醇接受能力來改善膽固醇逆轉(zhuǎn)運，從而減少脂質(zhì)積累[20]。上述研究表明，大多數(shù)主要成分都有抗炎，抗氧化，降糖降脂的作用，說明補陽還五湯是多種中藥協(xié)同作用，共奏益氣活血化瘀之功效，協(xié)同起效治療高脂血癥。

圖4 “補陽還五湯-化學(xué)成分-核心靶點-關(guān)鍵通路”多層次網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 關(guān)鍵靶點分析

關(guān)鍵靶點的分析主要針對以上篩選出來degree值排名前20的靶點。通過分析，可以發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點主要涉及轉(zhuǎn)錄因子，脂質(zhì)代謝相關(guān)因子和炎癥因子等。其中CREBBP和TP53是degree值最大的兩個靶點。

CREBBP，亦稱為CBP，是一種乙?；D(zhuǎn)移酶，由于在其與p300之間觀察到很高的序列同源性，所以現(xiàn)在將這兩種蛋白統(tǒng)稱為p300/CBP[21]。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（SREBP1C）是一種重要的脂肪生成活化劑，研究發(fā)現(xiàn)，在高葡萄糖和胰島素條件下，SREBP1C 在細(xì)胞和小鼠肝臟中均被p300/CBP 乙?；D(zhuǎn)移酶乙酰化，從而提高了其穩(wěn)定性，并向其脂肪形成靶基因啟動子募集[22]。碳水化合物反應(yīng)性元素結(jié)合蛋白（ChREBP）也被認(rèn)為是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)劑，與SREBP1C 協(xié)同作用以激活脂肪酸合成，研究發(fā)現(xiàn)p300/CBP 將 ChREBP 在 Lys-672 處乙酰化，從而通過增加其在培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞中靶基因啟動子的募集來增強其轉(zhuǎn)錄活性[23]。因此，p300/CBP 可能通過SCREBP1C 和ChREBP 的乙?；饔脕碚{(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成，所以p300/CBP可作為高脂血癥的脂肪代謝途徑的重要防治因子。

TP53 是一種抑癌基因，也稱P53，可參與脂質(zhì)代謝，葡萄糖代謝，核苷酸代謝等多種代謝途徑[24]。Vig等[25]研究表明p53 直接結(jié)合于SREBP-1 的啟動子區(qū)域，并在轉(zhuǎn)錄上抑制SREBP-1 的表達(dá)，從而抑制脂肪酸的合成。p53 轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)磷脂酰磷脂酶Lipin1，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶CPT1C 和丙二酰輔酶A 脫羧酶（MCD），從而促進(jìn)脂肪酸氧化并阻止脂質(zhì)在細(xì)胞中的蓄積[26-28]。

另外，PPARA 也是重要潛在靶點之一，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。PPARα 可調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝的平衡，在2型糖尿病中有重要作用[29]，PPARα 對脂肪酸的代謝有一定調(diào)節(jié)作用，主要通過調(diào)節(jié)過氧化物酶、脂肪酸運輸和線粒體脂肪酸β 氧化代謝基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，但是此作用必須通過PPARα 激動劑激活[30]。PPARα 的激動劑有很多，其中包括貝特類藥物，通過激活脂質(zhì)分解代謝，貝特類藥物持續(xù)降低患者的血漿甘油三酯，還能通過載脂蛋白A-I 和載脂蛋白A-II 提高人類血漿HDL，可用于治療血脂異常[31]。Tordjman K等[32]研究發(fā)現(xiàn)PPARα對高脂血癥的并發(fā)癥動脈粥樣硬化也有有益作用，PPAR-α 缺乏會改善ApoE 基因敲除小鼠的胰島素抵抗，并減少動脈粥樣硬化病變區(qū)域。常庚等[33]研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯可明顯升高2 型糖尿病大鼠模型PPARα/γ mRNA 表達(dá)以及降低糖代謝參數(shù)水平及血脂水平，提示補陽還五湯可能通過調(diào)節(jié)PPARα/γ mRNA 的表達(dá)以達(dá)到改善胰島素抵抗和降血脂的作用。

以上研究說明，靶點 CREBBP、TP53 和 PPARA 有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，糖代謝等作用，對于高脂血癥的防治有重要意義，同時，對其并發(fā)癥動脈粥樣硬化和糖尿病也有一定的作用。

3.3 通路結(jié)果分析

目前，有研究認(rèn)為，高脂血癥主要涉及脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥，與胰島素抵抗密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，KEGG 富集通路中，脂肪細(xì)胞因子信號通路與肥胖、胰島素抵抗、高血壓和血脂異常等疾病密切相關(guān)，脂肪細(xì)胞因子包括脂類（瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素和內(nèi)脂素）和經(jīng)典細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 等），通過調(diào)節(jié)血管功能、免疫和脂肪細(xì)胞代謝成為代謝綜合征發(fā)病機制的關(guān)鍵參與者[34]。多數(shù)研究證明，補陽還五湯可降低TNF，IL-6 等相關(guān)因子的表達(dá)[35-36]。高脂血癥的發(fā)生，發(fā)展以及并發(fā)癥常伴有炎癥[37]和內(nèi)皮功能障礙[38]，炎癥組織的特征在于低氧狀況和免疫細(xì)胞浸潤，TNF 信號通路和HIF-1 信號通路主要涉及炎癥反應(yīng)和缺氧[39]。Mylonis 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，HIF 對維持細(xì)胞代謝平衡起重要作用，因為HIF可以上調(diào)糖酵解通路以及降低線粒體功能，同時缺氧也可以增強脂肪生成，主要是因為涉及脂肪酸（FA）攝取，合成和儲存的基因由HIF 依賴性誘導(dǎo)，所以HIF 參與糖代謝與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。其他重要通路還包括PI3K-Akt 信號通路和FoxO 信號通路，二者功能密不可分，其中PI3K-Akt 信號通路作用廣泛，可調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，脂質(zhì)代謝，蛋白質(zhì)合成等[41]，F(xiàn)oxO 信號通路中FoxO 亞家族介導(dǎo)胰島素或類胰島素生長因子對涉及細(xì)胞代謝，生長，分化，氧化應(yīng)激，衰老，自噬和衰老的關(guān)鍵功能起到抑制作用[42]，F(xiàn)oxO1 可被PI3K-Akt 磷酸化所調(diào)節(jié)，所以PI3K/Akt 可通過FoxO1和GSK-3 調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，通過mTORC1 和SREBP調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[43]。上述研究表明，PI3K/Akt 與FoxO信號通路協(xié)同作用于糖脂代謝。Dae Hyun Kim 等[44]研究表明在高齡大鼠中，F(xiàn)oxO1 活性降低會導(dǎo)致高脂血癥和 PPARγ 升高，F(xiàn)oxO1 與 PPARγ 的相互作用可促進(jìn)肝脂肪變性，這是由于高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而導(dǎo)致Akt 信號傳導(dǎo)受損，例如與衰老相關(guān)的糖尿病。此外，有研究表明，p300/CBP 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的抑制作用顯著降低了空腹小鼠肝臟中FoxO1 的mRNA 和蛋白水平以及空腹血糖水平[45]。通過以上預(yù)測通路發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯治療高脂血癥主要集中于脂質(zhì)代謝、缺氧與炎癥通路，這對以后的研究是一個提示。

3.4 展望

本研究表明補陽還五湯可能通過作用于CREBBP、TP53、PPARA、TNF、IL6 等多個靶點，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子、TNF、HIF-1、PI3K-Akt 和 FoxO 等信號通路，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，炎癥反應(yīng)，缺氧，改善胰島素抵抗等機制治療高脂血癥。另外，補陽還五湯治療高脂血癥與高血糖密切相關(guān)，高血糖與高血脂緊密相關(guān)，其發(fā)病機制分別涉及糖代謝與脂質(zhì)代謝，糖脂代謝互相關(guān)聯(lián)且補陽還五湯可能同時作用于兩者發(fā)揮降糖降脂的作用，本研究提示補陽還五湯可能調(diào)節(jié)代謝用于高脂血癥或高脂血癥伴有高血糖的治療。該研究為深入探討補陽還五湯對高脂血癥的作用機制提供了指導(dǎo)。由于本實驗研究是基于生物信息學(xué)及大量數(shù)據(jù)庫的計算得出的結(jié)果，后續(xù)還需要進(jìn)一步的體內(nèi)外研究進(jìn)行驗證。