劉吉山，孫培姣，于 雪，苗立中，柳增善，尹梅芳，沈志強，，肖躍強*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；3.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春130062；4.濱州市濱城區(qū)梁才獸醫(yī)站，山東 濱州 256658)

Ⅰ群禽腺病毒(group Ⅰ fowl aviadenovirus,FAdV)是給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來諸多問題的病原體群，其病原復(fù)雜，感染率高，常與其他引起禽類呼吸道疾病的病原體混合感染，造成嚴重的經(jīng)濟損失。該群病毒血清型眾多，且血清型之間或同一血清型不同毒株的致病性不同，在臨床上的確診難度比較大。因此，早發(fā)現(xiàn)、早確診對控制該病毒的防控有重要作用。

FAdV傳統(tǒng)的診斷方法僅限于病毒分離，然后用血清學(xué)方法檢測，如免疫熒光分析、中和試驗或血細胞凝集抑制試驗等，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)檢測手段越來越多的應(yīng)用到病原體檢測。

1 病毒的分離

分離鑒定是一種經(jīng)典的病毒診斷方法，準確性和可靠性高，但其檢測周期較長。由于腺病毒的形態(tài)特性，用電子顯微鏡比較容易診斷，因此電子顯微鏡在禽腺病毒診斷中有重要作用。在感染禽腺病毒的肝臟中，用負染法染色后，用電子顯微鏡下可以觀察到二十面體的病毒顆粒。此外，用透射電子顯微鏡也觀察到了體積大致相等球形粒子[1]。然而，沒有純化的病毒，只根據(jù)形態(tài)學(xué)的特征不能進行分群或鑒別其血清型，且該方法不適用于臨床大規(guī)模檢測。

在FAdV感染的早期，可采集病變肝臟、腎臟及糞便等病毒含量高的組織及排泄物樣品，用腺病毒陰性雞胚分離病毒。首先選用被感染的病料組織器官，制成懸液，經(jīng)過卵黃囊接種5～7日齡雞胚，于接種后2～10 d可見雞胚死亡和發(fā)育停滯，胚體出血，肝臟有壞死灶，肝細胞中有核內(nèi)包涵體。王婉等[2]將臨床疑似雞包涵體肝炎病例的肝組織接種無特定病原體(specific pathogen free,SPF)雞胚，分離得到1株雞包涵體肝炎病毒，病理學(xué)觀察見肝組織出現(xiàn)典型病變，并伴有脂肪變性。通過卵黃囊和絨毛尿囊膜將雞腺病毒接種到鴨胚中，死亡的鴨胚中均伴有胚胎萎縮和病理性出血，且在胚胎的肝臟中觀察到了核內(nèi)包涵體。

也可用雞胚、雞胚及雞細胞等進行分離培養(yǎng)[3-4]，一般用雞胚肝、雞胚腎細胞來分離，用熒光抗體進行細胞染色檢查，確定 FAdVs 的感染。另外一種非特異的方法是對可以的細胞培養(yǎng)物用蘇木精-伊紅染色，觀察有無核內(nèi)包涵體[5]。有學(xué)者用雞胚腎細胞進行分離和培養(yǎng)了該病毒，細胞出現(xiàn)退化、脫落等病變，并且有嗜堿性核內(nèi)包涵體。AFZAL等[6]用QT 35 細胞和Vero細胞對引起HPS的腺病毒進行培養(yǎng)，結(jié)果病毒不能增殖，也未觀察到任何細胞病變，ROY等[7]在Vero細胞上盲傳4代，在接種96 h后觀察到了典型的細胞病變。

由于FAdV感染后所呈現(xiàn)的臨床癥狀與病毒血清型之間沒有明確的相關(guān)性，因此一般先從臨床表現(xiàn)、血清流行病學(xué)初步調(diào)查，并通常通過觀察組織病變和肝細胞的病理學(xué)切片進行初診[8]，后進行實驗室確診及病毒相關(guān)特性及分型的研究[9]。

除病毒分離外，實驗室常用的禽腺病毒檢測方法還有瓊脂擴散試驗(AGP)、間接血凝試驗、雞胚病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)等血清學(xué)和分子生物學(xué)方法。

2 血清學(xué)方法

2.1 血清中和試驗中和試驗是根據(jù)抗體能否中和病毒，使其失去感染性而建立的免疫學(xué)試驗。既可固定病毒滴度等量倍比稀釋血清，也可固定血清用量，與等量系列對數(shù)稀釋的病毒混合。雞感染FAdV后2～3 d可產(chǎn)生中和抗體，病毒中和試驗特異性和敏感性較強，可用于病原鑒定、確定血清型、檢測血清中抗體等[10]，但對檢測人員要求較高，費用高，耗時長。

2.2 瓊脂凝膠擴散試驗瓊脂擴散試驗(agar gel diffusion precipitation,AGP)為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含有電解質(zhì)的半固體凝膠(瓊脂或瓊脂糖)中進行的一種沉淀試驗，結(jié)果判定時以是否觀察到清晰白色的抗原抗體結(jié)合形成的沉淀為標準，出現(xiàn)則為陽性，反之則為陰性。該法不僅可以檢測抗原，也可用來檢測抗體，在獸醫(yī)臨床上有廣泛應(yīng)用。該試驗常用于鑒別抗原血清型、評價血清抗體陽性率以及抗體滴度，適用于對感染雞群進行抗體檢查。

張中秋等[11]將FAdV-1 型 OTE毒株經(jīng)尿囊腔途徑接種雞胚，以收獲的尿囊液作為AGP反應(yīng)抗原來檢測抗體，取得了滿意結(jié)果。智海東等[12]研制的禽腺病毒瓊脂擴散抗原可與1∶8以上稀釋的FAdV陽性血清反應(yīng)，最早可以在 8～12 h 出現(xiàn)沉淀線，且不與其他主要禽類病原體陽性血清反應(yīng)。對 3 月齡 SPF 雞進行人工感染腺病毒，第 7 天可檢測到沉淀抗體，血清中的沉淀抗體可持續(xù) 3 個月以上，該抗體可用于病毒感染的血清學(xué)檢測。此方法簡單、易操作，但耗費時間比較長，且對抗原要求濃度高、純度高，一般要將病毒進行純化濃縮處理，敏感性相對較差，且存在漏檢的可能。

2.3 ELISA檢測方法間接酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用于檢測簡便、快速、特異性強和靈敏度高，各種改進ELISA 常被用于檢測FAdV群特異性抗體和型特異抗體。由于標記酶酶促反應(yīng)的放大作用，其靈敏度比常規(guī)血清學(xué)檢測要靈敏的多，尤其適合大批量的血清學(xué)調(diào)查。

ELISA用于FAdV的檢測已有不少研究。SAIFUDDIN 等[13]建立的檢測組織及血液中 FAdV 群特異性抗原的ELISA檢測方法，能檢測出感染肝臟中小于 100 TCID50/mL的病毒。隨后SAIFUDDIN等[14]建立的ELISA檢測方法可以檢測FAdV的12種血清型。

CALNECK等[15]以10 個不同血清型的毒株作為包被抗原，與血清進行交叉反應(yīng)后結(jié)合，建立了檢測雞腺病毒抗體的ELISA方法。劉延珂等[16]以純化的 FAdV-4 中國流行株作為包被抗原，建立了一種快速檢測 FAdV-4 血清抗體的間接 ELISA 方法，與抗減蛋綜合征病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒陽性血清均無交叉反應(yīng)；批內(nèi)和批間最大變異系數(shù)小于5%；對40份來自疑似 FAdV-4 感染病雞的血清樣品進行檢測，結(jié)果與PCR 檢測結(jié)果符合率為100%。

Hexon蛋白是FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有主要的群和亞群特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇，與致病性密切相關(guān)，作為診斷抗原具有良好的應(yīng)用前景[17]。Hexon蛋白是中和抗體的靶目標和主要保護性抗原，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，抑制病毒體構(gòu)象的改變，從而中和病毒。由于不同血清型病毒的Hexon基因高度保守，因此可用Hexon重組蛋白做抗原檢測抗體水平。

文艷玲[18]和謝芝勛等[19]以純化好的Hexon蛋白作為包被抗原，建立間接ELISA檢測方法，然后用對12種血清型腺病毒免疫的SPF雞血清進行檢測，結(jié)果對1、4、5、8、9型的敏感性為100%，6、10、11型的敏感性為90%，對2、3、12型的敏感性為70%；與瓊脂擴散試驗相比，敏感性高20%。

在健康和感染FAdV的禽體內(nèi)都存在抗體的情況下，血清學(xué)檢測方法存在難以區(qū)分的問題。但鄧顯文等[20]以原核表達、純化后病毒非結(jié)構(gòu)重組蛋白33K重組蛋白為包被抗原，通過篩選和優(yōu)化間接ELISA的條件，建立了間接33K-ELISA抗體檢測方法，能成功鑒別病毒野毒感染與滅活疫苗接種。XIE等[21]用ELISA方法在人工感染FAdV的雞體內(nèi)檢測到病毒非結(jié)構(gòu)蛋白100K和33K的特異性抗體，而在用滅活疫苗免疫的雞體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)，他們發(fā)現(xiàn)可以用NSP的抗體區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。

2.4 間接免疫熒光試驗免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique ，IFA)始創(chuàng)于40 年代初，是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。國紀壘[22]通過自制FAdV 12 個血清型參考毒株的兔抗 FAdV IgG，經(jīng)過條件優(yōu)化建立了FAdV間接免疫熒光檢測方法，并檢測了FAdV侵害的主要靶器官，試驗證明，該方法快速、敏感、特異性高。

3 分子生物學(xué)方法

六鄰體蛋白(Hexon)是FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定族，與保護性免疫反應(yīng)有關(guān)，現(xiàn)已有不少根據(jù)Hexon基因建立的分子生物學(xué)檢測方法。

3.1 PCR法檢測近些年發(fā)展起來的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測方法已成功應(yīng)用于多種病毒的基因檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，可以在疾病的早期檢測感染禽類體內(nèi)的病毒，這樣可以更早地確診。自2015年以來，在北京、山東、河南等地發(fā)生的以心包積水、包涵體肝炎、腎炎、呼吸道癥狀等為特征的傳染病，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失。經(jīng)診斷多數(shù)為禽腺病毒FAdV-4感染，因此對FAdV進行分離鑒定及快速準確的檢測具有非常重要的意義。FAdV是DNA病毒，利用 PCR 方法可以快速、敏感的進行診斷，通常取病禽的肝臟或心包積水，提取基因組后進行 PCR。

由于不同血清型病毒的Hexon基因高度保守，因此根據(jù)Hexon基因設(shè)計建立的PCR診斷技術(shù)具有很高的敏感性和特異性。GANESH 等[23]從感染腺病毒的肝臟組織或全病毒中提取DNA，然后用特異性引物進行PCR，成功擴增出700 bp大小的Hexon片段，該片段隨后被用于斑點雜交法檢測病毒DNA的探針。THAKOR等[24]針對Hexon基因設(shè)計的特異性引物擴增產(chǎn)物890 bp，可以檢測野毒引起的禽腺病毒感染。何秀苗等[25]利用PCR方法，通過擴增其基因組的2個末端L片段、R片段、ITR片段，成功地對1株疑似FAdV的分離物(FAVI-JS)進行了鑒定。

同時，其中一些研究者將PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)相結(jié)合，即利用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)對FAdV進行分型及多態(tài)性分析。RAUE等[26]和HESS等[27]根據(jù)Hexon基因設(shè)計引物，擴增出1 319 bp的片段， 然后用HpaⅡ 酶對PCR產(chǎn)物消化，進行鑒定和多態(tài)性分析。MASE等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，用AluⅠ酶酶切短纖維基因可以用來區(qū)分各FAdV-4毒株。2009年，國內(nèi)唐熠等[29]根據(jù)編碼 FAdV 殼粒蛋白的Hexon基因序列設(shè)計合成兩對引物，能夠特異地擴增出 12 個血清型的 FAdV，結(jié)合運用HpaⅡ限制性內(nèi)切酶對 PCR 擴增產(chǎn)物酶切，能鑒定I群的12個血清型。

PCR方法從基因水平檢測病毒，特異性強，敏感度高，在發(fā)病早期就可以檢測到病原體，并且基本不需對樣品進行純化、培養(yǎng)、傳代等處理，極大地提高了該病的診斷速度。

3.2 Real-time PCR檢測法Real-time PCR技術(shù)實現(xiàn)了從常規(guī) PCR定性到定量的跨越。與常規(guī) PCR 相比，Real-time PCR 敏感性高、特異性強而且快速、高效、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷。

Real-time PCR技術(shù)所用的化學(xué)制劑包括能結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料(如SYBR Green I)和熒光基團標記的探針(如Taq Man探針)2種。熒光標記探針法敏感性好，特異性高，檢測結(jié)果準確，但需要設(shè)計探針，成本相對較高。而特異性熒光染料可以和所有 DNA 雙鏈進行結(jié)合，價格便宜，不需要對探針進行設(shè)計，但熒光染料可與體系中的特異、非特異擴增產(chǎn)物均能結(jié)合，導(dǎo)致試驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性，因此對引物的特異性和反應(yīng)體系的質(zhì)量要求很高。

目前，已經(jīng)有不少用Real-time PCR檢測FAdV的報道。趙雪麗等[30]建立了檢測FAdV-4的TaqMan MGB熒光定量PCR方法，最低檢出限1×101copies/μL，且與其混合感染或感染癥狀相似的其它病原體無交叉反應(yīng)。文艷玲等[31]根據(jù)Ⅰ群禽腺病毒六鄰體基因的保守序列設(shè)計的SYBR GreenⅠ熒光PCR方法可檢測I亞群腺病毒的12個血清型。方法的敏感性同朱余軍等[32]的液相基因芯片檢測技術(shù)相同。

唐熠等[33]建立并比較了Real-time PCR、PCR、半巢式PCR、LAMP等4種核酸檢測方法的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對陽性重組質(zhì)粒的檢測結(jié)果中，Real-time PCR敏感度最高，其次是半巢式PCR、LAMP，普通PCR敏感性最低。對不同病毒滴度(TCID50和ELD50)進行檢測，結(jié)果相同。

朱余軍等[32]根據(jù)Hexon基因的保守區(qū)設(shè)計特異引物，建立的檢測的液相基因芯片檢測技術(shù)特異性強，12 個血清型均為陽性，與ARV、IBV、EDSV、IBDV、MDV等均無交叉反應(yīng)；敏感度高，可達1×102copies/μL；檢測結(jié)果穩(wěn)定，批內(nèi)、批間變異系數(shù)都在 5% 以下，與 SYBR Green I 熒光定量 PCR方法檢測結(jié)果 100% 相符。

3.3 探針檢測法核酸探針技術(shù)是根據(jù)堿基互補配對原理，通過標記的核酸探針與互補靶基因片段進行雜交，以檢測樣本中的目的基因片段，具有特異性與敏感性強、快速準確等特點，現(xiàn)已在臨床疾病診斷和治療、基因多樣性的種性檢測及病原體的檢測等方面被應(yīng)用。根據(jù)核酸的來源和性質(zhì)，核酸探針可分為人工合成的寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針、RNA探針等幾類，目前針對病毒探針雜交檢測技術(shù)已經(jīng)比較成熟。

核酸探針按標記物可分為放射性和非放射性標記2大類。放射性同位素標記探針檢測靈敏度高，可到pg級；定位定量準確，方法簡便，但由于半衰期限制，標記后存放的時間有限，易造成放射性污染，許多實驗室都致力于發(fā)展非放射性標記的探針。目前，生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin)是應(yīng)用較多的非放射性標記物。

國外關(guān)于通過原位雜交技術(shù)直接檢測組織樣品中的FAdV DNA的方法已有報道。這些研究中使用的探針是根據(jù)FAdV-10五鄰體基質(zhì)的核酸序列和FAdV-1的相關(guān)DNA而設(shè)計[34-35]。

王鳳龍等[36]根據(jù)Hexon基因特點，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcolⅠ 雙酶切得到636 bp的基因片段，然后用地高辛標記制備DNA 探針，通過原位雜交技術(shù)直接檢測組織樣品中的病毒DNA，其靈敏度為 0.1～0.3 mg/L。董婷婷等[37]用地高辛標記，利用PCR的方法制備了FAdV-1、2、4、8及12血清型病毒的核酸探針，各血清型之間及與其他亞群之間無交叉反應(yīng)，最低檢測量為1 pg。崔楊[38]根據(jù)各個血清型Hexon基因特異性區(qū)域的特點，擴增到特異性的目的片段并以地高辛進行標記，成功獲得7個血清型病毒的特異的探針，經(jīng)過檢測探針的各型之間不存在交叉反應(yīng)，探針的靈敏度均在5 pg。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，于2000年由日本學(xué)者NOTOMI等[39]發(fā)明，在恒定溫度條件下開展核酸擴增的新技術(shù)，具有快速、特異、敏感、操作簡易等優(yōu)點。另外，其反應(yīng)產(chǎn)物可以不通過檢測儀器直接觀察結(jié)果，在基層條件較差的地方也能夠開展相應(yīng)的檢測工作，因此受到較大的關(guān)注。2010年，唐熠等[40]根據(jù) FAdV Hexon 蛋白基因保守區(qū)序列設(shè)計引物，建立了一種LAMP 快速檢測方法，敏感性可達1×101copies/μL，比PCR法略高；白元斌[41]針對FAdV-4設(shè)計的LAMP檢測方法，在檢測了臨床發(fā)病雞的 21 份肝臟樣品后，也得到了相同的結(jié)果。

目前，隨著研究者對檢測方法的改進，以及不斷出現(xiàn)新的檢測技術(shù)與方法，大大提升了檢測準確性與敏感性，必將為該病的防控起到積極重要的作用。

4 小結(jié)

FAdV在世界范圍內(nèi)普遍感染，血清型眾多，且不同血清型的致病性有較大差異，對病原認識不清，做不到有針對性的防制，是該病不斷蔓延、暴發(fā)的重要原因。目前，疫苗接種和注射卵黃抗體是有效防治FAdV感染所致疫病的重要手段，但病毒各血清型交叉保護性有限，必須選用與流行株匹配的疫苗和卵黃抗體才能有效，且我國目前還沒有商品化的疫苗。

近些年，禽腺病毒診斷方面取得的進展主要是在分子水平上，較之分離病毒等傳統(tǒng)方法，分子生物學(xué)方法在檢測混合感染上更具優(yōu)勢，PCR檢測技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到臨床上禽腺病毒的檢測。然而，由于禽類腺病毒的多樣性和禽類宿主的范圍廣泛性，仍有許多問題未得到解決。迄今為止，還沒有可以檢測12種血清型的PCR檢測方法，然而，隨著高致病性FAdV毒株的出現(xiàn)，這種通用的可以檢測不同血清型的方法顯得的尤為重要，由于禽腺病毒可垂直傳播，及時快速查清病原，淘汰病禽，對禽腺病毒的臨床診斷和有效防治有非常重要的意義。

除此之外，提高飼養(yǎng)管理水平，做好日常消毒工作，對防止病毒的擴散和傳播有一定作用。