白志元 楊玉花 武國(guó)平 衛(wèi)一超 張瑞軍*

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，太原 030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，太原 030031)

大豆起源于中國(guó)，已有五千多年的種植歷史，是人類食用植物性優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和植物油的重要來(lái)源[1]。2011—2017年，中國(guó)大豆總進(jìn)口量逐年遞增，嚴(yán)重影響著中國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，造成當(dāng)前局面主要原因是中國(guó)大豆單產(chǎn)較低，種植效益低，引起農(nóng)民種植大豆的積極性不高。雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象在生物界普遍存在，自花授粉作物水稻和谷子等已利用雜種優(yōu)勢(shì)大幅度提高了產(chǎn)量[2-4]。相對(duì)上述作物來(lái)說(shuō)，大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用研究相對(duì)滯后[5]，然而，中國(guó)在大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用領(lǐng)域處于世界領(lǐng)先水平，多家單位實(shí)現(xiàn)了三系(不育系、保持系和恢復(fù)系)配套，審定了多個(gè)雜交大豆品種[6-8]。本課題組在大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用中也進(jìn)行了有效的突破，審定了山西省首個(gè)雜交大豆品種-‘晉豆48號(hào)’[9]，篩選得到一批三系材料[10]。為了能更好地選育出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合，親本材料的改良顯得尤為重要，雜交育種研究表明，親本的親緣關(guān)系對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)有著重要的影響[11]?；诖?，有必要在三系親本改良中有目的地使其遺傳差異和親緣關(guān)系保持一定的距離。開(kāi)展品種間遺傳多樣性的研究，檢測(cè)其遺傳背景，明確品種間的親緣關(guān)系，可對(duì)大豆雜種優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。

SSR標(biāo)記具有簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、而且呈共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[12-15]。然而，應(yīng)用SSR對(duì)雜交大豆育種中親本改良方面的研究鮮有報(bào)道。本研究選用64對(duì)覆蓋大豆20條染色體的SSR標(biāo)記，對(duì)本課題組的68個(gè)大豆品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在明確其間的遺傳差異及親緣關(guān)系，以期為山西省三系雜交大豆育種中三系親本的遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所大豆雜優(yōu)課題組征集的68個(gè)大豆品種(系)作供試材料(表1)，其中，序號(hào)1～53為中國(guó)品種(系)，54～68 為美國(guó)品種。

1.2 基因組DNA的提取

取大豆幼嫩葉片，在液氮中研磨后，采用CTAB[16]法提取基因組DNA，采用紫外分光光度儀檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度。

1.3 引物，擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)

根據(jù)公布的SSR標(biāo)記信息(http:∥www.soybase.org/)，選用分布在大豆20條染色體上的64對(duì)SSR引物(表2)進(jìn)行分析，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

采用10 μL反應(yīng)體系，其中：0.5 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2 μL Primer(10 μmol/L)，1 μL 10×PCR buffer，0.1 μLTaqPolymerase(5 U/μL)，5 μL 模板DNA(10 ng/μL)，1.4 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，溫度退火30 s，72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。每對(duì)SSR引物具有特定的退火溫度，根據(jù)實(shí)際Tm值設(shè)定引物適合的退火溫度，其他程序不變。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染、拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)SSR電泳銀染結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在相同的遷移位置，有擴(kuò)增條帶賦值為“1”，無(wú)條帶賦值為“0”。SSR引物位點(diǎn)的多態(tài)性信息量PIC(Polymorphism information content)，計(jì)算公式為：

式中：PIC表示位點(diǎn)i的PIC值，pij表示位點(diǎn)i的第j個(gè)等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率。材料間的遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity，GS)按Nei等[17]的方法計(jì)算。根據(jù)GS值，以不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行遺傳相似性聚類。統(tǒng)計(jì)分析在NTSYS-PC 2.1軟件系統(tǒng)下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

本研究用分布于大豆20條染色體的64對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)68個(gè)大豆品種(系)包括53個(gè)中國(guó)品種(系)和15個(gè)美國(guó)品種進(jìn)行擴(kuò)增。表2可見(jiàn)，共檢測(cè)到375個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位變異數(shù)為5.86個(gè)，變化范圍為2.00～12.00個(gè)。位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.366～0.900，平均為0.677，其中，引物Satt380最高，為0.900，引物Satt211最低，為0.366。

表1 供試大豆品種(系)名稱Table 1 The name of tested soybean varieties (lines)

表3可見(jiàn)，53個(gè)中國(guó)品種(系)共檢測(cè)出373個(gè)等位變異，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位變異數(shù)為5.83個(gè)，變化范圍為2.00～12.00個(gè)，其中，引物Satt380和Satt358這2對(duì)等位變異數(shù)最多，均為12個(gè)，引物Satt211和Satt684這2對(duì)等位變異數(shù)最少，為2個(gè)；位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.370～0.909，平均為0.682，引物Satt380最高，為0.909，引物Satt211最低，為0.370。15個(gè)美國(guó)品種共檢測(cè)到288個(gè)等位變異，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位變異數(shù)為4.50個(gè)，變化范圍為2.00～9.00個(gè)，其中，有10對(duì)引物的等位變異數(shù)為2個(gè)，Satt380等位變異數(shù)最多，為9個(gè)；位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.309～0.817，平均為0.590，引物Satt266最高，為0.817，引物Satt460，Satt511最低，為0.309。

表2 64對(duì)SSR引物及所在連鎖群、等位變異數(shù)和PIC值Table 2 Linkage groups, amplified allele numbers and PIC value of 64 SSR primers

表3 64對(duì)SSR引物分別在53個(gè)中國(guó)品種(系)、15個(gè)美國(guó)品種中等位變異數(shù)和PIC值Table 3 Allele numbers and PIC value of 64 SSR primers in 53 Chinese varieties (lines) and 15 American varieties

2.2 供試大豆品種(系)間的遺傳差異與遺傳關(guān)系

68個(gè)大豆品種(系)的遺傳相似系數(shù)(GS)，其變幅為0.529～0.973，平均GS值0.707。其中，53個(gè)中國(guó)品種(系)間的變幅為0.529～0.973，平均GS值0.690，9(‘晉大78’)和30(‘中豆20’)的遺傳相似系數(shù)最小為0.529，50(‘征19’)和51(‘征21’)的遺傳相似系數(shù)最大為0.973；15個(gè)美國(guó)品種的變幅為0.714～0.870，平均GS值0.772，56(‘Ina’)和66(‘Defiance’)、61(‘Emerald’)和64(‘Amsoy’)、62(‘Rend’)和65(‘Spry’)、64(‘Amsoy’)和68(‘Avery’)的遺傳相似系數(shù)最小，皆為0.714，58(‘Omaha’)和65(‘Spry’)的遺傳相似系數(shù)最大為0.870；53個(gè)中國(guó)品種(系)與15個(gè)美國(guó)品種兩組間的變幅為0.566～0.854，平均GS值0.693，39(‘阜9721-6’)和66(‘Defiance’)的遺傳相似系數(shù)最小為0.566，16(‘魯99011’)和60(‘Darby’)的遺傳相似系數(shù)最大為0.854。

圖1可見(jiàn)，68個(gè)大豆品種(系)共聚成2類(以GS值0.65為標(biāo)準(zhǔn))。其中第Ⅰ類包括1(‘晉遺20’)、3(‘晉遺34’)、5(‘晉豆24’)、53(‘H3’)、17(‘山寧16’)、2(‘晉遺30’)、4(‘晉豆19’)以及6(‘晉豆25’)8個(gè)品種(系)，其余60個(gè)品種(系)被聚在第Ⅱ類。第Ⅱ類在相似系數(shù)0.69處又可分為5個(gè)亞類：第Ⅰ亞類含有5個(gè)品種，分別為12(‘邯豆6號(hào)’)、22(‘濟(jì)4103’)、18(‘臨豆10號(hào)’)、34(‘中黃13’)和35(‘中黃37’)；第Ⅱ亞類含有14個(gè)品種，分別為23(‘徐0705’)、24(‘徐0801’)、26(‘徐豆15’)、25(‘徐豆13’)、29(‘鄭州126’)、37(‘科9302’)、41(‘周豆11’)、42(‘皖豆28’)、38(‘阜97211-76’)、39(‘阜9721-6’)、49(‘征10’)、27(‘濉科8號(hào)’)、30(‘中豆20’)和46(‘征1’)；第Ⅲ亞類含有31(‘中豆40’)和52(‘征46’)2個(gè)品種；第Ⅳ亞類含有32個(gè)品種(系)，包含供試的全部美國(guó)品種，其余17個(gè)中國(guó)品種(系)分別為7(‘晉豆35’)、33(‘中作06818’)、16(‘魯99011’)、48(‘征07’)、43(‘鐵豐31’)、19(‘臨9909’)、32(‘中作045387’)、47(‘征3’)、11(‘冀豆17’)、13(‘邯豆9號(hào)’)、21(‘荷豆18’)、40(‘遠(yuǎn)育6號(hào)’)、20(‘荷豆12’)、50(‘征19’)、51(‘征21’)、9(‘晉大78’)和10(‘汾豆93’)；第Ⅴ亞類包括14(‘魯豆11’)、28(‘淮豆267’)、8(‘晉豆59’)、36(‘誘處30’)、15(‘魯96150’)、44(‘鐵豐61’)和45(‘瑩豆812-04’)7個(gè)品種。

圖中序號(hào)見(jiàn)表1。See Table 1 for the serial number in the figure.圖1 68個(gè)大豆品種(系)的SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性聚類圖Fig.1 Dendrogram of 68 soybean varieties (lines) based on genetic similarity by SSR molecular markers

3 討論與結(jié)論

SSR分子標(biāo)記技術(shù)不易受環(huán)境影響，且多態(tài)性好，已成為研究作物遺傳多樣性的主要手段。王彩潔等[12]研究自20世紀(jì)40年代，中國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)不同年代大面積種植品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，平均等位變異數(shù)為5.48個(gè)，等位變異的變化范圍為1.00～14.00個(gè)，黑龍江省北部及中南部、吉林省和遼寧省和黃淮海地區(qū)的位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC)依次為0.414，0.469，0.522和0.562。張海平等[14]研究山西省野生大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性分析結(jié)果，多態(tài)性信息含量(PIC)為0.201 9～0.858 4，平均0.679 7。Wang等[15]對(duì)山西省大豆育成品種、地方品種和野生資源遺傳多樣性分析結(jié)果，多態(tài)性信息含量(PIC)為0.585～0.850，平均為0.780。本研究結(jié)果表明，64對(duì)SSR標(biāo)記所揭示的68個(gè)大豆品種(系)的等位變異數(shù)變化范圍為2～12個(gè)，平均為5.86個(gè)，其中53個(gè)中國(guó)品種(系)平均為5.83個(gè)，15個(gè)美國(guó)品種平均為4.50個(gè)；總的位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC變化范圍為0.366～0.900，平均為0.677，其中53個(gè)中國(guó)品種(系)平均為0.682，15個(gè)美國(guó)品種平均為0.590。本研究位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC)介于二者之間，高于育成品種，低于地方品種，表明68個(gè)大豆品種(系)遺傳多樣性相對(duì)豐富，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，作為種質(zhì)資源利用及三系親本的改良具有一定的價(jià)值。

利用聚類分析將不同來(lái)源的大豆品種(系)進(jìn)行分類，明確其親緣關(guān)系，可為三系雜交大豆親本改良保持一定的遺傳距離提供參考依據(jù)。本研究中68個(gè)大豆品種(系)聚為2大類，第Ⅰ類有8個(gè)材料，其中，三系親本保持系有3個(gè)，分別為1(‘晉遺20’)、5(‘晉豆24’)和53(‘H3’)，基于此可把該類品種(系)作為保持系改良親本；第Ⅱ類在相似系數(shù)0.69處又可分為5個(gè)亞類，其中，第Ⅱ亞類38(‘阜97211-76’)與39(‘阜9721-6’)、第Ⅲ亞類52(‘征46’)、第Ⅳ亞類33(‘中作06818’)與32(‘中作045387’)和第Ⅴ亞類45(‘瑩豆812-04’)為三系親本的恢復(fù)系，在各自亞類的基礎(chǔ)上參照聚類品種(系)進(jìn)行恢復(fù)系的改良。在大豆種質(zhì)類群劃分研究上，已有很多的報(bào)道，SSR聚類結(jié)果與地理來(lái)源之間存在較大相關(guān)性，同一區(qū)域內(nèi)大面積種植品種的同質(zhì)化現(xiàn)象相當(dāng)明顯[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果與地理來(lái)源具有一定相關(guān)性，15個(gè)美國(guó)品種都聚在第Ⅱ類中的第Ⅳ亞類，4個(gè)來(lái)源于徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品種都聚在第Ⅱ類中的第Ⅱ亞類。然而，并不是同一地理來(lái)源的品種就會(huì)聚在一類，如山西省的10個(gè)品種，6個(gè)聚在第Ⅰ類，4個(gè)聚在第Ⅱ類，這也是通過(guò)SSR標(biāo)記對(duì)大豆品種類群劃分的意義所在。15個(gè)美國(guó)品種的位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC)低于53個(gè)中國(guó)品種(系)的PIC，表明中國(guó)的大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富，15個(gè)美國(guó)品種與17個(gè)中國(guó)品種(系)聚在了第Ⅱ類中的第Ⅳ亞類，產(chǎn)生該結(jié)果可能是中國(guó)品種選育中利用了美國(guó)品種，為驗(yàn)證該設(shè)想，對(duì)其中的育成品種進(jìn)行了系譜信息查詢，發(fā)現(xiàn)‘鐵豐31’和‘冀豆17’等品種有美國(guó)品種的直接親緣關(guān)系[18-19]。此外，對(duì)系譜來(lái)源不清的8個(gè)品系劃分到相應(yīng)的類群，53(‘H3’)劃分在第Ⅰ類，46(‘征1’)和49(‘征10’)劃分在第Ⅱ類中第Ⅱ亞類，52(‘征46’)劃分在第Ⅱ類中第Ⅲ亞類，48(‘征07’)、47(‘征3’)、50(‘征19’)和51(‘征21’)劃分在第Ⅱ類中第Ⅳ亞類。一些系譜來(lái)源不清的大豆種質(zhì)被劃分至不同類群中，依據(jù)此結(jié)果進(jìn)行三系親本改良，可以避免盲目測(cè)配，提高利用效率。